金标快速检测检测试剂卡检测技术110325-02

1、克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的检测 -农业部畜禽产品质量安全监督检验测试中心（石家庄,饲料中添加-兴奋剂的原因,兴奋剂的危害,中国政府监控情况,兴奋剂的使用现状,兴奋剂检测方法,检测方法对比,确认方法,筛选方法,检测方法标准,农业部1025号公告-11-2008猪尿中-受体激动剂多残留检测 液相色谱-串联质谱法 农业部1063号公告-3-2008动物尿液中11种-受体激动剂的检测 液相色谱-串联质谱法 农业部1025号公告-16-2008动物尿液中盐酸克仑特罗残留检测 气相色谱-质谱法 NY /T 933-2005尿液中盐酸克仑特罗的测定 农牧发200138号文件猪尿中盐酸克仑特罗检测方法-

2、酶联免疫吸附测定法,农业部1025号公告-6-2008动物性食品中莱克多巴胺残留检测 酶联免疫吸附法 NY/T1460-2007饲料中盐酸克仑特罗的测定 酶联免疫吸附法 农业部1025号公告-18-2008动物源食品中-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法 农业部1063号公告-6-2008饲料中13种-受体激动剂的检测 液相色谱-串联质谱法,克伦特罗金标检测试剂条的原理和使用,一、盐酸克伦特罗简介 二、金标免疫试剂条原理 三、金标快速检测试剂条检测操作步骤 四、注意事项 五、样品的提取方法 六、其它类金标速测试剂条简述,一、盐酸克伦特罗简介,何为“瘦肉精”,盐酸克伦特罗（Clenbute

3、rol Hydrochloride ，CL） 4-氨基-（叔丁胺甲基）-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐,1、药理作用,克伦特罗又名双氯醇胺，氨哮素，克喘素，是一种人工合成的2-肾上腺素受体激动剂（2-激动剂）。白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，熔点161，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。 具有强效松弛支气管平滑肌，扩张支气管的作用，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。 当其应用剂量达到治疗量的510倍时，又具有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦肉精,2-肾上腺素受体激动剂,2-肾上腺素受体激动剂（2-激动剂）包括：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、西马特

4、罗、菲诺特罗、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗、奇帕特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗等十几种。我们目前监测的主要是克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇（有快速检测方法的,注：+表示增加，表示减少,激动剂对畜禽生长作用的影响,2、克伦特罗（瘦肉精）的同化作用,瘦肉精等非法使用途径,1、养殖环节：拌入饲料中和饮水中添加，用以增重、增加瘦肉率、改善毛色和体型； 2、收购、贩卖中注射或饮水中添加，导致生猪大量饮水，以保持体重、改善毛色等； 3、部分违法分子收羊后，秘密集中饲养20-30天，大剂量添加、饲喂。 4、部分违法分子专门加价收购添加、饲喂瘦肉精的肉畜,在畜牧业生产中一些非法使用者将其作为一种

5、生长促进剂添加到动物饲料中，用以改善胴体的品质； 同时也造成动物性食品中盐酸克伦特罗（瘦肉精）的残留。 当人们食用含有盐酸克伦特罗（瘦肉精）残留的产品后会产生一定的中毒症状,3、克伦特罗的毒性,心血管系统：心悸、心慌、头晕头痛等临床症状 神经系统恶心、呕吐、肌肉疼痛、肌肉颤抖、兴奋、不自主地颤抖、运动障碍 禁忌症 心脏病、糖尿病、高血压、青光眼、甲亢,中 毒 剂 量,人医用药量： 0.02 0.5 g/kg 中毒一般含量： 肝脏 100 500 g/kg 中毒极端含量： 肝脏 19 5395 g/kg,4、代谢和残留状况,半 衰 期,第一半衰期：10h 第二半衰期：64.8h（2.5d,用药剂

6、量：16g/(kg.d) 持续时间：20d 停药与残留： 停药时间 肝脏残留浓度 0 d 73.8ng/g 15 d 2.4ng/g 35 d 0.7ng/g,日粮中添加2mg/kg CL停药后猪尿液中CL浓度变化,猪尿中CL的消除曲线,5、中毒事件,在互联网上用“瘦肉精中毒”搜索，可以查到有6710项的相关报道。世界上最早的“瘦肉精”中毒事件于1990年3月在西班牙发生。我国则于1998年5月在香港最早出现。 1、2003年8月22日，广东信宜市发生530人瘦肉精集体中毒事件 2、2002年2月浙江省平湖市170余名群众发生瘦肉精中毒 3、2001年11月2日，北京发生14人瘦肉精中毒 4、

7、 2001年11月，广东河源市发生484人食用含瘦肉精的猪肉后集体中毒的事件，闻名全国 5、1999年10月，浙江嘉兴市发生57人“瘦肉精”（含盐酸克伦特罗)集体中毒事件 6、1998年，广东高明市发现有7例因喝猪肺汤致人中毒事件,二、金标免疫试剂条原理介绍,利用了免疫层析的技术 特点： 1：检测速度快，515分钟就可知道结果。 2：不需要任何仪器设备； 3：操作简便； 4：灵敏度高，可达到ng级水平,两种金标检测试剂： 1、金标检测试剂条 2、金标检测卡,1、金标检测试剂的历史,1971年由Faulk 和Taytor发明，目前在医学方面得到了日益广泛的应用。 90年代传入我国，已经用于检测

8、HBsAg（乙肝）、HCG（早孕） 、HIV（艾滋病）、梅毒等疾病，具有简单、快速、准确和无污染等优点，我国已经有几十家药厂生产医学检验用的金标试纸。 目前，该项技术已开始应用于药物残留和疫病等的检测,几个概念,1、什么是抗原抗原是能刺激机体产生抗体（免疫球蛋白，Ig）,并能与产生的抗体发生特异性结合的物质。医学上重要的抗原有细菌（如NGH），病毒（如HBV、HCV、HIV），螺旋体（如TP），蛋白质（如AFP）等。2、什么是抗体？抗体是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，是免疫应答的产物。它与相对应的抗原能发生特异性的结合（如锁与钥匙的关系一样，一把钥匙开一把锁），与其他抗原不发生结合。 临

9、床上的免疫学检测方法就是根据抗原抗体高度特异性结合的原理设计。可以用已知的抗原检测未知的抗体，也可用已知的抗体检测未知的抗原,2、金标检测技术的基本原理,金标免疫检测试纸条系统使用一种特殊的多孔膜（NC膜）作为固相载体。该膜具有很强的蛋白吸附功能，抗体抗原吸附于NC膜并经干燥处理后即作为固相，可与液相中的相应标记了胶体金的抗原抗体快速结合。 在湿润状态下，液相中的抗原抗体免疫金可因“灯芯引流现象”作快速定向泳动并与固相另一抗原决定簇单抗结合，形成特异的金标记抗体抗原抗体红色沉积线，表现出抗原抗体的特征反应,金标试纸条工作原理,是将各种反应试剂以条带状固定在同一试纸条上，待检标本加在试纸条的一端

10、，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上渗滤、移行并与膜上另一种试剂接触，样品中的待测物同层析材料上针对待测物的受体（如抗原或抗体）发生特异性免疫反应。层析过程中免疫复合物被截留、聚集在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的,金标免疫检测试纸条的结构,主体的膜反应体系由以下部分组成：1： 高蛋白亲和性的高分子纤维素膜（NC膜），为反应膜用来作为系统反应的载体和显示反应结果。2：选用有较强吸水能力的玻璃纤维，经特殊处理后，为反应系统提供适合的反应条件，并帮助吸水。 3：吸附力较强的玻璃纤维，作为金标记物

11、的固相载体。 4：吸收垫，吸水，牵引反应物的运动。5：塑料基板，作为反应体系的支撑物,金标检测技术的基本原理,氯金酸(HAuCl4)在还原剂（柠檬酸）作用下，可使金离子还原成金原子，并聚合成一定大小的金颗粒，形成一种胶体溶液。把这种溶液称为胶体金。 胶体金具有很大的表面积，可将抗原、抗体等蛋白质吸附到胶体金颗粒表面,吸附的机理是胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固的结合,用还原法可以方便地把氯金酸制备成各种不同大小直径的金颗粒、金颗粒的大小不同，颜色也不同,金溶胶颜色 蓝 紫 紫红 红 橙红 橙吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518直径(nm

12、) 147 97.5 71.5 41 24.5 15 一般使用40 nm的金颗粒，因为灵敏度较高,塑料底板,样品吸收垫,玻纤,纤维素膜,滤纸,金标试剂条示意图,金颗粒上标记抗原,克伦特罗分子,BSA,金颗粒,在玻纤上喷抗原标记的金颗粒,标记抗原的金颗粒,玻纤,在纤维素膜上喷克伦特罗抗体,纤维素膜,抗体,试剂条组装,被标记的金颗粒,抗体,样品垫,滤纸,克伦特罗金标试纸条的工作原理,加入样品,样品流动,样品中没有克伦特罗时,T线,金颗粒上的克伦特罗和纤维素膜上的抗体结合，金颗粒聚集在一起，形成红色的条带，结果为阴性,样品中有高浓度的克伦特罗时,由于样品中克伦特罗的分子数量很多，大大多于金颗粒上的克

13、伦特罗，抗体上都结合了样品中的克伦特罗，而金颗粒不能结合到抗体上，造成金颗粒穿过抗体条带到滤纸上，纤维素膜上为白色,克伦特罗分子,T线,样品中含有少量的克伦特罗时：如5ppb以下,样品中克伦特罗分子较少时，和交联在金颗粒上的克伦特罗互相竞争，有少量的金颗粒吸附在纤维素膜上，行成颜色较浅的T线,T线,因此，随着样品中克伦特罗浓度由高到低，试纸上T线上的颜色由浅到深,5ppb,1ppb,0.5ppb,0ppb,在医学上使用的各种金标试纸条，如艾滋病、乙肝、海洛因等检测试纸条，要求非常严格。纤维素膜上除喷上抗体形成T线（Test）外，还喷有形成C线（Control）的抗体。 C线应在检测过程中的任何

14、情况下都应该出现，否则就证明试纸条在运输、保存等过程中发生了意外情况，如高温、潮湿等，导致试剂条失效。这样就有了一个试剂本身质量的判定标准，避免由于试剂保存等原因造成的假阳性或假阴性等情况的出现,T线,C线,这样，在高浓度的情况下，即使T线不出现，只要C 线出现，就知道试剂没有问题。而如果连C线都没有，则可知道是试剂有问题，该包装的试剂应该弃用。这样就避免了假阳性的结果,检测原理示意图,胶体金颗粒表面包被有可以识别待测药物的抗体 检测线包被有药物-BSA偶联物，可以识别胶体金上的抗体 质控线包被有可结合胶体金颗粒的抗体,三、 克伦特罗金标试剂的使用(杭州迪恩科技公司产品,产品包装,每个锡箔袋中

15、装5个测试卡； 两袋干燥剂防止试剂受潮; 每盒中装有12个锡箔袋，共60个测试卡，另外还装有60个塑料吸管,产品可于室温下阴凉避光干燥处贮存，有效期12个月（无需在冰箱中保存）。 检测阈值：3ng/mL 检测不需要其它任何的辅助仪器,操作步骤1.检测准备,1）根据检测样品和标准品的数量确定需要 的试纸条数量，并取出； （2）在金标试剂空白处写上样品编号,写编号,2、操作步骤,第一步：在室温下，将测试卡平放在桌面上； 第二步：用试剂包装中所带的塑料吸管吸取尿液或其它提取样品； 第三步：在加样孔中滴三滴样品，5分钟内判读结果,3.结果判定,阳性（+）：仅质控区（C）出现一条紫红色带，在测试区（T）

16、内无紫红色条带出现。表明尿液中的克伦特罗残留物大于3ppb。 阴性（-）：两条紫红色条出现。一条位于测试区（T）内，另一条位于质控区内（C）。表明尿液中不含克伦特罗残留物或尿液中的克伦特罗残留物小于3ppb,阴性,阳性,未加样,操作示意图,结果判读,阴性（）：T 线和C 线都显色，表示样品中盐酸克伦特罗浓度低于检测限。 阳性（）：T 线无显色C 线显色，表示样品中盐酸克伦特罗浓度高于检测限。 无 效 ：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸卡已变质失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸卡重新测试,金标读数仪：美国产品可以进行定性和定量的检测分析；体积小，重量轻，便于携带；适合于基

17、层应用单位使用,四、注意事项,1.检测前请详细阅读说明书并做好准备工作； 2.每加完一个样品必须更换移液枪吸头或滴管； 3.本试剂的检测结果仅作为筛查，对于判定为阳性或者可疑的样本应该用另外的检测方法（如LC/MS/MS或GC/MS）作进一步的确定；4.本产品提供的各种物品及试剂只供本检测试验用，不能作为其他用途；5.做多个样品检测时，试纸条加入检测样品的量尽量一致,6.在加样孔中滴三滴样品，3-5分钟内判读结果，不要延长时间。 7. 注意试纸条的干燥保存，避免受潮，切忌冷冻；打开包装后，应在1小时内尽快使用。8.每条试纸只能使用一次，请在有效期内使用；9.多个样品同时检测时请做好标记； 10

18、.本产品仅作为筛查，对于判定为阳性或者可疑阳性样本应该用另外的检测方法作进一步确定（如GC/MS或LC/MS/MS,五、样品的提取方法,一、尿液 现场检测一般无需前处理过程，直接点样。 尿液样品必须收集在洁净干燥，不含任何防腐剂的塑料尿杯或玻璃容器中。若不能现场检测，可封样带回实验室检测，尿样在2-8冷藏可保存4 小时，长期保存需冷冻-20，严禁反复冻融。检测前尿样需回温到室温，如尿样浑浊，需3000rpm以上离心5min后检测,二、组织提取方法 方法1： 1.1、用刀具粉碎组织样品 1.2、用适量粉碎后样品置于离心管中 1.3、于沸水中煮泡5分钟，取出离心管室温放置10-15分钟 1.4、用

19、滴管吸取离心管中的组织渗出液，加1滴在检测卡的加样孔中 1.5、再用滴管加入缓冲液2滴，5分钟后判断结果,方法2： 2.1、用超声仪或类似仪器将样品均质化（或简单用刀具粉碎组织样品）。 2.2、取约5g均质化后的样品置于10ml试管中。 2.3、加约5ml3%三氯乙酸。 2.4、涡旋混匀后抽提10min（间隔震荡2-3次,2.5、离心3000rpm5分钟。 2.6、用滴管取10滴（约250ul）上清液转移入小离心管中。 2.7、加入1滴（约25ul）1N NaOH调整PH至7左右。 2.8、用滴管加入3滴提取液在检测卡的加样孔中，5分钟后判定结果,三、饲料提取方法 1、用刀具粉碎饲料样品； 2

20、、用1g粉碎后样品置于试管中，加入3ml蒸馏水； 3、50度左右温浴5分钟，静置5-10分钟使不溶物完全沉淀（为节省时间，也可离心加速不溶物完全沉淀）； 4、用滴管加入3滴上清液在检测卡的加样孔中，5分钟后判断结果,国家标准 2003年国家颁布了GB/T 5009.192-2003动物食品中克伦特罗残留测定，液相色谱法,六、其它类金标速测试剂条简述 莱克多巴胺金标检测试剂条 沙丁胺醇金标检测试剂条,莱克多巴胺金标检测试剂条,莱克多巴胺(RCT)盐酸是一种苯酚胺类肾上腺素激动剂，能选择性激动支气管平滑肌的2受体，临床上普遍用于支气管哮喘治疗。 20世纪80年代的动物试验表明，当用药量为治疗剂量的

21、5-10倍时，牛、猪、羊和家禽等多种动物体内的营养成分由脂肪向肌肉转移，表现为营养“再分配效应”，可以增强脂肪分解代谢，显著增加酮体瘦肉率，提高饲料转化率，因此作为一种新型促生长添加剂可能在畜产品生产中使用，但人类食用含有该残留的畜产品会引发食物中毒,目前除了美国批准其可为猪的饲料添加剂，在欧洲，中国禁止使用，但事实上常有非法使用情况的报道。在体育比赛中，RCT可增强运动员、动物(如马)肌肉，提高运动成绩，国际奥委会已将其列为禁用药物。因此，不论从食品安全检测还是体育赛事兴奋剂检测方面对莱克多巴胺的检测都具有重要意义,技术指标,灵敏度：本品肉眼判定灵敏度为5ng/ml。结合金标读数仪，判定检测

22、灵敏度为1ng/ml。 产品可于室温下阴凉避光干燥处贮存，有效期24个月。忌冷冻或在已过有效期后使用,国家标准,2006年国家颁布了GB/T20189-2006 饲料中莱克多巴胺药物残留测定，采用高效液相色谱 2007年国家农业部颁布了958号公告 -4-2007动物组织及动物尿液中莱克多巴胺残留检测，采用高效液相色谱,检测原理,莱克多巴胺免疫金标速测卡应用竞争抑制免疫层析的原理，样本中的莱克多巴胺在侧向移动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上莱克多巴胺BSA偶联物的结合。如果样本中莱克多巴胺含量大于5 ng/mL，检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显红

23、色，结果为阴性,样品处理,猪尿： 用干燥、洁净的离心管或适当容器采集50mL左右尿液。如果不立即检测，可将尿样冷冻保存；短期可进行冷藏保存，要注意避免腐败造成失效或污染。如果尿样出现沉淀或浑浊物，请离心后再检测。出现阳性结果时应按法定程序分瓶封装样品用于确证法检测,样品处理,组织样（畜禽肉）应当避光冷藏保存。 1、 取去脂肪组织样本于均质机中均质1min（10000r/min）， 2、 称取2.5g均质物于15ml离心管中，加入5mL 0.1M HCl，振荡混匀10min； 3、 加入100L 4M NaOH， 剧烈振荡30秒后，室温下4000 r/min 离心15min； 4、 转移全部上清

24、于离心管中，加入50L 4M NaOH，振荡混匀，再加入8ml 乙酸乙酯，振荡5min； 5、 取上层有机相6mL于试管中，65氮(空)气吹干； 6、 向吹干的试管中依次加入0.3mL正己烷和0.3mL PBS，充分溶解试管壁上残留物，静置分层后，吸取至少100 L下层溶液检测,使用步骤,测试前请完整阅读使用说明书，并将试剂板和待检样本溶液恢复至常温。 从包装袋中取出试剂板后请尽快使用； 用滴管吸取待检样品溶液，于加样孔中滴加3滴，加样后开始计时； 结果应在35分钟读取，其他时间判读无效； 读取结果时，试剂板水平置于观察者正面,结果判断,阴性（）： T线（测试线，靠近加样孔一端）比C线（对 照

25、线）深或一样深，表明样品中莱克多巴胺浓度低于 5g/kg 或不含莱克多巴胺残留。 阳性（）： T线比C线浅，或T线无显色，表明样品中莱克多巴胺浓度高于5g/kg；T线相比C线越浅，表明样品中莱克多巴胺浓度越高。 无效：未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂板重新测试,注意事项,请勿触摸试剂板中央的白色膜面； 请勿使用过期的试剂板； 本公司提供的滴管请勿重复使用； 本公司提供的试剂请勿食用； 若需直接检测标准品，请用我方提供的PBS缓冲液进行配制,特异性,使用本产品检测100ng/mL沙丁胺醇标准品，结果显示为阴性。 本产品与链霉素、四环素、氯霉素

26、、磺胺类等药物无交叉反应,精密度,同时用本产品和莱克多巴胺ELISA检测试剂盒对包括146份阴性样本和140份阳性样本的286份样品进行检测，结果表明本产品与莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的结果符合率为94.4,沙丁胺醇,沙丁胺醇为选择性2受体激动剂，能有效地抑制组胺等致过敏性物质的释放，防止支气管痉挛。适用于支气管哮喘、喘息性支气管炎、支气管痉挛、肺气肿等症,沙丁胺醇不良反应,较常见的不良反应有：震颤、恶心、心率增快或心搏异常强烈。 较少见的不良反应：头晕、目眩、口咽发干。 逾量中毒的早兆表现：胸痛，头晕，持续严重的头痛，严重高血压，持续恶心、呕吐，持续心率增快或心博强烈，情绪烦躁不安等,检测原理,沙丁胺醇免疫金标速测卡应用竞争抑制免疫层析的原理，样本中的沙丁胺醇在侧向移动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上沙丁胺醇BSA偶联物的结合。如果样本中沙丁胺醇含量大于5 ng/mL，检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显红色，结果为阴性,样品处理,猪尿： 用干燥、洁净的离心管或适当容器采集50mL左右尿液。如果不立即检测，可将尿样冷冻保存；短期可进行冷藏保存，要注意避免腐败造成失效或污染。如果尿样出现沉淀或浑浊物，请离心后再检测。出现阳性结果时应按法定程序分瓶