四神丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜细胞间黏附分子的影响分析

1、四神丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜细胞间黏附分子的影响分析溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）以腹痛腹泻、黏液脓血便持续或反复发作为主要表现，因发病原因及机制尚不明确，加之缠绵难愈，复发率高，且有癌变倾向，目前尚缺乏满意的治疗方法，已被列为现代难治病之一【1】，因此有关病因病机的探讨及治疗药物的研发已成为近年来的研究热点。有研究表明，四神丸能有效改善溃疡性结肠炎黏膜炎症、促进溃疡的修复【2】，但分子作用机制不清。细胞间黏附分子-1（ICAM-1）属于黏附分子的免疫球蛋白超家族，存在于内皮细胞表面。研究表明，在活动性UC患者及动物模型中，炎症结肠黏膜上的ICAM-1表达增加，

2、是参与疾病发生发展的重要因子之一【3】。本实验在前期研究的基础上进一步探讨四神丸对实验性UC大鼠结肠黏膜ICAM-1蛋白和基因表达的影响，以期从分子水平探讨四神丸治疗UC的疗效及作用机制。1 实验材料1.1 动物SPF级Wistar大鼠40只，体质量（180±10）g，雌雄各半，甘肃中医学院科研实验动物中心提供，SPF级动物质量合格证号：SCXK（甘）2004-0006。1.2 试剂2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS），美国Sigma公司生产，批号2008162；TRIzol试剂（批号19919）、琼脂糖（批号0000101394）均购自Invitrogen公司；反转录试剂盒（批

3、号0000007526）、PCR试剂盒（批号108030404）均购自Promega Corporation。一抗ICAM-1、SP免疫组化染色试剂盒、DAB染色试剂盒均购自北京博奥森生物工程开发有限公司。1.3 仪器美国BIO-RAD S1000TM型PCR仪，美国BIO-RAD凝胶成像仪、电泳槽、电泳仪，美国Bio-RAd核酸定量分析仪，德国3-16PK型通用台式高速离心机，海尔DM-86L626型立式超低温冰箱等。成都太盟BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统。1.4 受试药物四神丸原方出自证治准绳，甘肃中医学院附属医院药剂室制备。按照原方24212比例取肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴

4、茱萸、大枣，用8倍量70%乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取药渣。合并3次醇提取液，滤过，滤液减压回收乙醇后得醇提取浓缩液，醇提取浓缩液干燥得干膏，干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏，4 冰箱保存备用。柳氮磺吡啶（SASP）每片0.25 g，国药准字H32020026，上海三维制药有限公司生产。2 实验方法2.1 造模参考文献【2】采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型：将Wistar大鼠60只，禁食（不禁水）24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 mL/100 g）后，一次性将TNBS/乙醇液（100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 mL）

5、用橡胶输液管轻缓注入大鼠距肛门约78 cm深的肠腔内，留置数分钟。然后用针头抽取一定量的空气，同样的方法注入大鼠肠腔，防治溶液外漏，让动物保持平躺状态，自然清醒。空白组10只大鼠采用等量生理盐水灌肠。2.2 分组与给药将实验动物分为空白组、模型组、四神丸组及SASP组，每组10只。除空白组外均以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 mL混合试剂灌肠。四神丸组均给予四神丸浸膏剂5 g/kg灌胃（按照临床成人用量的10倍折算），SASP组按0.3 g/kg剂量灌胃，灌胃体积均为10 mL/kg，空白组、模型组灌服等体积生理盐水。各组于造模后第2日开始灌胃，每日1次，连续3周。3周后处死

6、，取标本。2.3 取材末次灌胃给药后大鼠禁食24 h（不禁水），脱颈椎法处死大鼠，取血后迅速剖腹，取出距肛门以上8 cm处结肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冷PBS缓冲液冲洗肠内容物，肉眼观察各组大鼠肠组织大体形态并进行评分，取病变最明显处0.5 cm左右，迅速移至液氮中保存，用于ICAM-1 mRNA表达检测。2.4 肠黏膜大体形态评分大体形态损伤评分参照Luketal标准【4】进行。0分：无损伤；1分：充血但没有溃疡；2分：充血而且肠壁变厚但没有溃疡；3分：有一处小溃疡，直径约01 cm；4分：溃疡较大，直径约12 cm，但肠管与外周脏器无粘连；5分：溃疡直径12 cm，肠管增厚，与周围脏器粘

7、连严重。2.5 免疫组化法检测结肠组织细胞间黏附分子-1蛋白表达采用经典的SABC法。主要步骤：将固定好的石蜡切片常规脱蜡至水。每张切片滴加3%H2O2，室温放置10 min。将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）中进行抗原热修复，自然冷却至室温，滴加5%BSA封闭液，室温20 min。分别滴加ICAM-1一抗，4 冰箱过夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37 培养箱中孵育20 min。滴加试剂SABC，在37 培养箱中孵育20 min。DAB显色剂，苏木素轻度复染3 min；经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察结果，拍片。染色对照：同一组片中，用PBS

8、代替一抗作孵育，其余步骤同上。ICAM-1蛋白主要表达于大鼠结肠组织中的肠道黏膜及黏膜下层，以胞浆为主。ICAM-1表达阳性为胞质呈棕黄颗粒染色，颜色越深则表达越强，未出现棕黄颗粒为阴性。采用BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统，随机选取5个视野，测量阳性细胞平均积分光密度值（IOD），其值越大则蛋白表达强，反之则表达弱。2.6 RT-PCR检测结肠组织细胞间黏附分子-1 mRNA表达总RNA的提取采用经典的Trizol法，应用Bio-RAd核酸定量分析仪测定总RNA的浓度和纯度，确保2.0A260/A2801.8。参照反转录试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA，用cDNA模板对大鼠内

9、参照β-actin及ICAM-1基因分别进行PCR扩增，引物由金唯智生物科技北京有限公司合成。内参照β-actin引物序列为：上游引物5-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3，下游引物5-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3，扩增产物长度292 bp；ICAM-1引物序列为：上游引物：5-GTCTCAGAAGGGGACCAAGT AA-3，下游引物：5-GCAGAGCAAAAGAAGCGTCGTT-3，产物长度196 bp。扩增反应体系为50 ?L，其中cDNA 3 ?L、上下游引物各1 ?L；MgCl2 3 ?L、10xReaction Buffer 5

10、?L、dNTP Mix 1 ?L；Tap DNA聚合酶 0.25 ?L；无酶水补足至50 ?L。扩增参数为：预变性95 、2 min，95 变性45 s，退火53 、45 s，72 、延伸30 s，共40个循环（β-actin为25个循环），总延伸72 、5 min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪上成像，采用QuantityOne图像分析软件分析数据，获得各电泳条带的积分光密度（X），用β-actin的积分光密度（A）作为内参照，计算基因的相对表达量（X/A）。3 统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以x±s表示，组间均

11、数比较采用方差分析。P0.05）。结果见表1。4.3 细胞间黏附分子-1蛋白表达检测结果空白组：ICAM-1蛋白少量表达；模型组：ICAM-1蛋白表达较强，数量较多；SASP组：ICAM-1蛋白表达较弱，数量较少；四神丸组ICAM-1蛋白表达较弱，数量较少，与SASP区别不大。阳性细胞平均积分光密度值结果见表2、图1。4.4 RT-PCR半定量结果空白组大鼠结肠黏膜ICAM-1的表达处于较低水平，用TNBS/乙醇灌肠造模后表达量显著升高（P0.01），经四神丸治疗后与模型组比较，ICAM-1表达水平降低（P0.05，P0.01）。见表3、图2。5 讨论UC是一种与免疫直接相关的肠道慢性非特异性

12、炎症性疾病【5】。中医认为本病的发生是由于饮食、劳倦、情志损伤等因素导致五脏失调引起。本病发生虽然与饮食伤脾密切相关，但由于本病病程长，五脏所伤、穷必及肾;，所以本病发病日久易引起肾虚。因肾主二便，肾虚则大便失约而为泄泻，临床治疗从肾虚;论治UC是重要思路。四神丸原为治疗脾肾阳虚所致的五更泻的有效方剂，出自证治准绳，是温补脾肾、涩肠止泻的良方。四神丸药味简单、疗效确切、取材方便，是一种治疗肠炎的常用中成药，受到历代医家的推崇【6】。临床以四神丸为基础方治疗慢性结肠炎、虚寒性腹泻、过敏性结肠炎等消化道疾病疗效甚佳。现代医家采用四神丸为基础方加减治疗溃疡性结肠炎报道甚多，且疗效显著，如王氏【7】采

13、用四神丸加味治疗26例溃疡性结肠炎，能明显改善患者腹痛腹泻、黏液脓血便症状，且远期疗效稳定。但四神丸整体方剂的药理学研究相对较少，如孙氏等研究发现四神丸能调节肠道平滑肌活动，增强消化系统功能，并能降低小肠推进率，同时减慢小肠对炭乳的排空速度。从基因和蛋白表达水平揭示四神丸治疗溃疡性结肠炎的疗效机制少有报道。四神丸配伍精良，方中补骨脂苦辛性温，善补命门之火以温煦脾土，在方中重用为君；肉豆蔻能温中涩肠，与君药相伍既可增强其温肾暖脾之力，又兼涩肠止泻之用，为臣药；五味子酸温，固肾涩肠，吴茱萸温脾暖胃以散寒，共为佐药；用法中姜、枣同煮，枣肉为丸，可调和脾胃，以助药物吸收。方中诸药合用，共奏补脾温肾、固

14、肠止泻之效。临床用于治疗UC疗效显著，但其作用机制不明。本实验从蛋白和基因水平探讨四神丸的作用机制，旨在为防治UC提供依据。黏附分子是一类具有多种生物功能的受体型跨膜糖蛋白，能介导细胞趋化、淋巴细胞归巢、黏附等，参与免疫反应和炎症，在机体的病理和生理过程中发挥重要作用。近年来，UC与黏附因子的关系受到人们的高度重视，其中ICAM-1与UC关系最为密切。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族的成员之一，在生理情况下，ICAM-1不表达或很少表达，当受到内毒素或者炎性细胞因子（如TNF-α、IL-1等）刺激后可表达于多种细胞上。ICAM-1的表达上调使血管内皮细胞与白细胞大量牢固黏附，

15、从而促进炎细胞渗出血管到达炎症部位，同时使白细胞释放更多细胞因子和炎性介质，ICAM-1与炎性细胞因子互相作用加重炎症形成恶性循环，特别是在中性粒细胞向炎症部位聚集并导致组织损伤的过程中起着重要作用。有人发现活动期UC患者外周血ICAM-1显著增高，在肠组织中表达也增高，且与病情轻重呈正相关。本研究发现，空白组大鼠结肠黏膜中ICAM-1蛋白和基因表达较弱，与空白组比较，模型组大鼠结肠黏膜中ICAM-1蛋白和基因表达上调，而治疗组（SASP、四神丸）ICAM-1蛋白和基因表达量明显下调。而且本次实验发现ICAM-1蛋白和基因表达量与结肠黏膜组织的损伤程度呈正相关，也支持上述研究结果。上述研究结果

16、表明，ICAM-1的表达参与了UC的发病，四神丸治疗UC的作用机制可能是发挥温肾健脾的整体调节作用，通过下调ICAM-1mRNA和ICAM-1蛋白的表达量，抑制炎症细胞的浸润，阻止并减轻结肠组织损伤，起到治疗UC的作用，其与多种炎症细胞因子的相互作用机制，有待进一步研究。参考文献：【1】 王新月，王建云.溃疡性结肠炎中医药治疗的关键问题与优势对策.中华中医药杂志，2012，27（2）：263-266.【2】 路晓红，杨恩来，赵霞，等.溃疡性结肠炎免疫机制的研究进展.山西中医学院学报，2011，12（1）：66-68.【3】 李楠，王雪明，翟俊山，等.复方血竭对溃疡性结肠炎大鼠模型结肠组织细胞因

17、子的调节作用.中国实验方剂学杂志，2008，14（l）：53-54.【4】 Hristine C， Michel C， Lecannu G. The prebiotic characteristics of fructooligosaccharides are necessary for reduction of TNBS-induced colitis in rats. J Nutr，2003，133（1）：21-27.【5】 Bendjelloul F， Rossmann P， Maly P，et al. Detection of ICAM-1 in experimentally induced colitis of ICAM-1-deficient and wild-type mice：An immunohistochemical study. Histochem J， 2000，32：703-709.【6】 周枫，刘端勇，赵海梅.四神丸治疗消化道疾病研究概述.江西中医药，2011，42（11）：61-63.【7】 王颀.四神丸加味治疗溃疡性结肠炎26例.现代中医药，2012， 32（6）：13-14. 孙世晓，张韵娴.