实验11大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA的转化

1、 大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA的转化 南京大学 生命科学学院生技基地 一、实验目的 1、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2、学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞、外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术。 二、实验原理 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生

2、物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 转化的方法： 1. 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热2击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 2. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入

3、体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl ，RbCl(KCl)等2化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl和RbCl(KCl)法，2RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl 法简便易行,且其转化效2率完全可以满足一般实验

4、的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl法为使用更广泛。 2受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变， 1 使外源DNA能够进入；进入受体细胞的DNA分子可表达其携带的某些基因（如抗生素抗性、酶等选择标记基因），使转化细胞在选择培养基上表现出不同于未转化细胞的特征，从而可将转化细胞选择出来。 筛选的原理是：本次实验用于转化的质粒带有用于大肠杆菌篮白筛选的相关酶基因，可使受体菌在含对应底物的选择培养基上呈现蓝色，受体细胞本身缺乏相应基因，呈现白色。 二、实验主要仪器设备 1、恒温摇床 2、电热恒温培养箱 3、冷冻

5、台式高速离机 4、无菌工作台 5、低温冰箱 6、恒温水浴锅 7、制冰机 8、分光光度计 9、微量移液枪 三、实验材料 1、大肠杆菌DH5 2、带有质粒pUC18的大肠杆菌 四、实验试剂 1、含0.2葡萄糖的LB液体培养基（pH7.27.4）： 称取蛋白胨10克，牛肉膏5克，氯化钠5克，加蒸馏水800毫升溶解上述试剂，用1mol/LNaOH调pH7.27.4，补加蒸馏水至1000毫升。8磅/英寸2灭菌30分钟。 2、含0.2葡萄糖LB固体培养基：LB液+1.8琼脂，8磅/英寸2灭菌30分钟。 3、转化缓冲液(TSS)： 100ml LB中加入 10g PEG8000， 6ml DMSO 5ml

6、1M MgSO4 4、氨基苄基青霉素（Apm）液（20mg/ml）：称取Apm（医用粉剂）20毫克，加无菌蒸馏水1毫升，临用时配制。 5、 IPTG（异丙基-b-D-硫代半乳糖苷）贮存液（100mmol/L）：1.19 g （IPTG 2 分子量为238.31）IPTG加水至50 ml，过滤除菌后-20避光保存。 6、铺平板用LB固体选择培养基（含Amp、IPTG、Xgal）： 将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右，加入： （1）Amp储存液，使终浓度为50ug/ml； （2）IPTG贮存液，使终浓度0.1mmol/L； （3）Xgal贮存液，使终浓度20 ug/ml 摇匀后铺板。

7、五、实验方法和步骤 一）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl法) 2（1）从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期, OD600 1左右。 将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右。 （2）每人取2个离心管，转入3ml培养液（1.5mlX2），在冰上冷却2-3min，于4，4000rmin离心5min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）； （3）倒净上清培养液，按照0.75ml/管，用冰冷的0.1mo1L Ca

8、Cl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴15 min ； （4）4000rmin离心5min； （5）弃去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置2小时后，即制成了感受态细胞悬液； 二）细胞转化 （1）取1 l质粒DNA加入 100l感受态细胞，轻轻摇匀，冰上放置30min （2）于42水浴中保温1min，然后迅速冰上冷却2min 三）平板培养 （1）取各样品培养液20ul或50ul，涂布于含Amp抗菌素的LB平板培养基上，（用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。 （2） 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)。 六、实验结果观察 细胞生长良好，转化细胞呈蓝色分布，转化率较高（如图1）。 3 1 感受态细胞制备 图 七、实验讨论 实验的常见问题、关键问题及难点：, 如离心管所用器皿, 1、杂菌污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 且注意防止被其,所有的试剂都要灭菌tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理为以的转入, 所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA它试剂、DNA酶或杂DNA 后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 2、试剂的浓度和质量。 、感受态细胞的质量。3704、细胞的生长状态：要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度-20或菌