人类疾病动物模型

1、人类疾病动物模型,第一节 人类疾病动物模型定义和意义 第二节 人类疾病动物模型的分类 第三节 免疫缺陷动物模型 第四节 转基因动物模型,第一节：人类疾病动物模型定义,人类疾病动物模型(Animal models of human diseases)是指在医学研究中，在动物身上建立，或形成类似人类疾病动物。通过动物模型直接，或间接反映疾病的发生和发展过程，在了解疾病的基础上开创和改进、优化疾病的治疗,人类疾病动物模型的意义,1.避免直接实验所造成危险。 2.临床上平时不易见的疾病可以随时复制。 3.增加方法学上的可比性。 4.样品易得，实验方法简化。 5.有助于了解疾病的本质,1.避免直接实验所

2、造成危险。 古人尝白草 肿瘤 损伤 中毒,2.临床上平时不易见的疾病可以随时复制 发病率低：遗传疾病，传染病，内分泌疾病 潜伏期长：动脉粥样硬化 病程长：慢性哮喘，甲亢 放射病，毒气中毒，烈性传染病,3.增加方法学上的可比性 年龄，性别，体质，遗传，社会因素等，都对疾病发生发展起着一定的影响作用。 动物模型，认为设计，遗传背景等各项条件都很清楚，或可以控制，因此可以排除外因干扰,4.样品易得，实验方法简化 动物模型，可按需要采集各种样品，其中包括处死收集标本。取材方便，简化了试验方法。 5.有助于了解疾病的本质 临床研究带有一定的局限性 同一病原体对人和动物的感染 观察遗传因素对疾病发生发展的

3、影响 可以用单一病因短时间复制出人类疾病,动物疾病模型具有的特点,应再现所要研究的人类疾病，动物疾病表现应与人类疾病相类似； 动物能重复产生该疾病，最好能在2种动物体复制该病； 实验动物合格，动物背景资料完整，生命周期要满足实验需要； 动物要价廉、来源充足、便于运送； 尽可能选用体型小的动物,第二节：人类疾病动物模型的分类,一.医学动物模型基本分类 1诱发性动物疾病模型(Experimental animal model) 是指以物理学、化学、生物学等致病手段，人为导致动物组织、器官或整体成为人类疾病动物模型；使其在功能、代谢、形态结构等方面发生改变，即人为地诱发动物产生类似人类疾病模型,应用

4、：药理学，毒理学，免疫学，肿瘤学和传染病等 优点：简便，条件简单，其他因素容易控制，短时间内可大量复制 不足：诱发动物模型在某些方面与自然产生的疾病模型有所不同；某些疾病不能用人工方法诱导,2自发性动物模型(Spontaneous animal model) 是指不加任何人工诱发，在自然条件下动物自然产生的疾病，或者由于基因突变的异常表现，通过遗传育种保留下来的动物疾病模型。其中包括近交系的肿瘤疾病模型和突变系的遗传性疾病模型,常用的自发突变模型,高血压模型 （SHR大鼠,肥胖模型 （Zucker大鼠,糖尿病模型 GK大鼠,肥胖并糖尿病模型 （db/db小鼠,优点：在一定程度上减少人为的因素，

5、更接近自然的人类疾病。 缺点：目前发现的种类有限。 近交系肿瘤模型，因实验动物种属，品系不同，其肿瘤发生类型，机理有所不同 疾病动物需要饲养条件要求高，操作技术性强,3抗疾病型动物模型(Negative animal model) 是指特定的疾病不会在某种动物身上发生。因此，可借以探讨何种动物对该疾病有天然的抵抗力,4生物医学动物模型(Biomedical animal model) 是指以动物生物学特征提供人类疾病相似表现的疾病模型,二、按系统范围分类,1疾病基本病理过程动物模型 是指致病因素在一定条件下作用于动物后，所出现的共同性的功能、代谢和形态结构某些改变的动物模型。 这种动物模型的致

6、病因素不是某种疾病所特有的，而是各种疾病都可能共同发生的。 是研究疾病机理和药物筛选理想的方法,2各系统疾病动物模型 是指与人类各系统疾病相应的动物模型，如神经、心血管、呼吸、消化、泌尿等系统疾病相应的动物模型,A.神经系统 1大鼠囊状脑动脉瘤 结扎大鼠颈总动脉，同时佐以脱氧皮质酮和高渗盐水处理，饲喂含有氨基丙睛的饲料，复制囊状动脉瘤模型，为研究人类脑动脉瘤与血液动力学的关系，病变的发展及发病机理提供有益的帮助,2结扎大鼠中动脉的大鼠卒中模型 结扎大鼠大脑中动脉，复制中风模型其优点是能产生非致命性的孤立性病灶损害，可提供长期的行为学和生物化学的研究,3.维生素A缺乏引起的兔脑积水模型 选用雌性

7、幼兔，饲以限制维生素A饲料，诱发兔脑积水。该模型优点是易复制，易收集胎兔和新生兔的标本样品，通过血清维生素A的监测，可控制血清中维生素A的浓度，有利进行生化和形态学的研究,B.心血管系统 1.动脉粥样硬化 长期以来用兔饲以高脂肪、高胆固醇饲料诱发动脉粥样硬化的动物模型。给小型猪饲喂高脂肪、胆固醇饲料诱发动脉粥样硬化病变，其解剖部位，病理特点均与人类相似，有时还伴有心肌梗塞，较易饲养管理，小型猪是一种很好的模型动物,2心肌缺血和心肌梗塞 电刺激法：雄性成年免麻醉后，用弱、强刺激(弱为0.81.6毫安，强为46毫安)交替刺激右侧下丘脑背侧核，复制心肌缺血动物模型； 药物法；给大鼠、兔注射异丙肾上腺

8、素，犬静脉给予麦角新硷制备冠状动脉痉挛模型； 冠状动脉阻断法：应用大鼠、犬麻醉后,分离冠状动脉套上自制的冠状动脉压迫环，制备心肌缺血和心肌梗死模型,3高血压 目前，应用最广泛的是日本学者培育的突变系SHR大鼠。该鼠自发性高血压的变化与人类相似，并且可产生脑血栓、梗塞、出血、肾硬化、心肌梗死和纤维化等变化。在SHR的基础上，又培育了两个亚系SHRSP和SHRSR，前者出生后，除出现严重高血压外,90以上患脑卒中(脑出血和脑栓塞)；SHRSR则是抗脑卒个的自发性高血压大鼠,C.呼吸系统 1用异性蛋白注射致豚鼠过敏症动物模型，包括支气管痉挛、哮喘和过敏性休克。1974年Petterson和Kelly

9、发现狗可以对空气中过敏原(草、树、灰尘和猫抗原)引起过敏症的模型。主要表现为豚草花粉病、患犬出现眼结膜炎、鼻炎、重度搔痒性皮炎，血液内有抗脉草抗原的循环抗体，相当于人体免疫球蛋白IgE。这些是临床研究和生产检定过敏症的动物模型,2慢性支气管炎和肺炎 70年代初学者应用SO2、烟雾、甲醛蒸气、辣性气体等制备诱发性猴、免、大鼠、小鼠的慢性支气管炎动物模型。 有人先后将木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白溶解酶分别注入兔，大鼠，地鼠气管内诱发肺气肿,D.消化系统 1先天性高胆红素血症模型：已发现非洲啮齿类胃溃疡、地鼠的肝淀粉样变、羊和大鼠的先天性高胆红素血症动物模型。尤其是South-downe变

10、种羊，因其先天性肝脏摄取有机阴离子缺陷(胆红素)，造成血中未结合的胆红素增高,2小牛轮状病毒性肠炎模型： 轮状病毒性肠炎对人类及许多动物都能引起感染，如小鼠、兔、羊、猪等。在实验中发现人类与动物可交叉感染，小牛轮状病毒性模型有利于生产大量血清与抗原，便于手术、粪便特征容易监测，是传染病学、生理学研究较好模型,3豚鼠溃疡性结肠炎模型： 豚鼠口服变质角叉菜(从红海藻中提取)溶液，产生溃疡性结肠炎、临床表现与人类溃疡性结肠炎相似，是研究溃疡性的发病机理、综合症对全身影响，和治疗方法的模型,E.泌尿系统 1.诱发性肾小球肾炎模型： 给兔、猫、狗注射异种抗肾血清、细菌抗原与肾组织复合抗原，以及抗原抗体诱

11、发动物肾小球肾炎模型,2.自发性肾脏疾患模型： 如芬兰的Landrace羊羔中有一种发展迅速致死的肾小球肾炎，伴有肾小球免疫荧光复合物的沉积。 狗、猫自发的免疫介导肾小球肾炎动物模型,3.继发性肾炎模型： 小鼠淋巴脉络膜炎、乳酸脱氢酶、鼠类的白血病病毒感染等均能复制继发性肾炎,F.内分泌与代谢 (1)手术糖尿病模型 ： 自从德国的Won Mening将犬作胰腺全切除术，造成糖尿病后，陆续报道猫、大鼠、兔、猪、猴等切除80一90胰腺，并受到高糖饮食刺激后，引起永久性糖尿病,2)化学物质损伤胰岛细胞： 链脲佐菌素(STZ)一次腹腔或静脉注射30一100mgkg几天后可使狗、大鼠等动物产生永久性高血

12、糖。 四氧嘧啶(A11oxan)一次静脉或腹腔注射30150mgkg，可复制糖尿病模型，但可造成肝、肾组织的损害，而且较多的资料证明，它在生理上不同于人类所患的糖尿病。 环丙庚哌,给大鼠连续给药4周后，可见高血糖症状。 鼠脑炎、心肌炎(EMC)病毒M型变异可诱发若干品系的成年小鼠糖尿病，如DBA2、CD-l、C3H、C57BL、BALBcj,3)遗传性及自发性糖尿病： kk小鼠由日本杂种小鼠交配得来的遗传性糖尿病小鼠，其生物特性类似ob小鼠，属先天遗传缺陷性小鼠。 C57BLks小鼠是一种具有db基因的近交小鼠，其表现多食肥胖及血糖升高，类似人类中年肥胖合并糖尿病 中国地鼠(黑线仓鼠)有50自

13、发产生糖尿病，属多基因遗传，病鼠耐糖曲线类似人类型非胰岛素依赖性)糖尿病。 BB Wistar系大鼠：是一种典型自发遗传 I型(胰岛素依赖性)糖尿病的动物模型。其临床表现为多饮、多食、体重下降、高血糖及酮尿,三、中医证候动物模型,中医动物模型经30余年的研究，已形成独特的体系。为中医基础病理学、基础药理学研究提供了重要依据,1960年发现,过量使用肾上腺皮质激素的小鼠表现为阳虚征象：体重下降、萎靡、耐寒力低。 1963年又发现用助阳药(附子、肉桂、淡众蓉、仙灵脾)能治疗这种状态。 1964年，易宁育用六昧地黄汤治疗类似阴虚的肾性高血压大鼠。 1977年，上海中医学院用肾上腺皮质激素和甲状腺，加

14、利血平复制小鼠阳虚、阴虚模型并用助阳药、滋阴药治疗。 1979年，张启元尝试用灌喂大黄煎剂“泻下伤脾”，建立小鼠脾虚证模型 。 1988年，由杨云主持研究的“劳倦和饥饱所致大鼠脾虚证模型”获得国家中医药管理局科技进步二等奖,四、设计动物模型的注意事项,1尽可能再现所要的人类疾病的模型 。 复制模型时必须强调从研究目的出发，熟悉诱发条件、宿主特征、疾病表现和发病机制，充分了解所需动物模型的全部信息，分析时候能得到预期结果。 要避免选用与人类对应气官相似性很小的动物作为疾病模型 动物模型.doc,2注意选用标准化和实用价值高的动物。 模型应适用于多数研究者使用，容易复制，实验中便于操作和采集各种标

15、本。 动物来源必须充足，选用多胎分娩的动物对扩大样本和重复实验是有益的。尤其对慢性疾病模型来说，动物须有一定的生存期，便于长期观察使用，以免模型完成时动物已频于死亡或毙于并发症。 野生动物在自然环境中观察有助于正确评价自然发病率和死亡率。复制模型时必须注意动物种群的选择，要了解各类动物种群的特点和对复制动物的影响,用于生物医学研究的动物种群，可按其遗传成分和其环境被研究人员控制的程度，分为三种基本类型： 实验室类型，它们可提供最大程度的遗传和环境操作； 家养类型，不论是乡村或城市饲养的，人类对其干扰的程度不同，且动物环境与人类环境可为能极为接近； 自然生态类型。几乎没有人为的干扰。可能某种动物

16、（啮齿目、食肉目、兔形目）可按所有三类类型进行研究，这就增加了对环境和遗传因素作比较研究的可能性。 在选用三类动物种群复制动物模型时，必须了解它们各自的优点和缺点 不同类型的动物种群的优点和缺点.doc,注意环境因素对模型动物的影响 复制模型的成败往往与环境的改变有密切关系。拥挤、饮食改变、过度光照、噪音、屏障系统的破坏等，任何一项被忽视都可能给模型动物带来严重影响。除此以外，复制过程中固定、出血、麻醉、手术、药物和并发症等处理不当，同样会产生难以估量的恶果。因此，要求尽可能使模型动物处于最小的变动和最少的干扰之中,不能盲目地使用近交系动物,不然会导致不能控制的因素进入实验 例如自发性糖尿病大

17、鼠(BB、Wistar)除具有糖尿病临床特征外，还发现多种病理变化（外周神经系统严重病变、睾丸萎缩、甲状腺炎、胃溃疡、恶性淋巴瘤等）。因此要有目的地选择。半个世纪以来，近交系的开发不断提供着新的动物模型材料，大、小鼠疾病作为模型在医学使用量已高达7090,利用近交系作动物模型时还必须认识到： 1.动物形成亚系后不应该再视为同一品系。要充分了解新品系的特征和背景材料。 2.即使作为已形成模型的品系，由于不适当的育种方法和环境改变，还可发生新的基因突变和遗传漂变；即存在着变种甚至断种的危险。 3国外经常取用二种近交系的杂交一代（F1）作为模型。其个体之间均一性好，对实验的耐受性强，又多少克服了近交

18、系的缺点。但盲目引进F1代动物对复制所要求的模型是缺乏意义的,动物进化的高级程度并不意味着所有器官和功能接近于人的程度 复制动物模型时，在条件允许的情况下，应尽量考虑选用与人相似、进化程度高的动物作模型。但不能因此就认为进化程度越高等的动物其所有器官和功能越接近于人。例如，非人灵长类诱发动脉粥样硬化时，病变部位经常在小动脉、即使出现在大动脉也与人类分布不同。据报导用鸽（White Gameau Pigeon）作这类模型时，胸主动脉出现的黄斑面积可达10%，镜下变化与人也比较相似，因此也广泛被研究者使用,正确地评估动物疾病模型 应该懂得没有一种动物模型能完全复制人类疾病真实情况，动物毕竟不是人体

19、的缩影。模型实验只是一种间接性研究，只可能在一个局部或几个方面与人类疾病相似。因此，模型实验结论的正确性只是相对的，最终必须在人体身上得到验证。复制过程中一旦出现与人类疾病不同的情况，必须分析其分岐范围和程度，找到相平行的共同点，正确评估哪些是有价值的,第三节：免疫缺陷动物模型,免疫缺陷动物是指由于先天性遗传突变，或用人工方法，培育一种或多种免疫功能缺陷的动物。 免疫缺陷动物开创了肿瘤学、免疫学、细胞生物学的新的里程碑,分类,按免疫功能缺陷的种类常分为: 1.T-淋巴细胞功能缺陷动物：裸小鼠、裸大鼠、裸牛、裸豚鼠等。 2.B-淋巴细胞功能缺陷动物：CBA/N小鼠、Arabin马和Quarter

20、马等马属动物。 3.NK细胞功能缺陷动物：Beige小鼠。 4.联合免疫缺陷动物：Scid小鼠等其他人工定向培育的多种免疫功能缺陷动物,常见的免疫缺陷动物,1.裸小鼠 是指先天性无胸腺，且无被毛的小鼠,简称为裸小鼠。其突变基因为裸基因,符号为:nu,是一个隐性突变基因,位于小鼠的第11号染色体上。目前，此基因已导入到不同品系的小鼠中,常见的有BALB/c-nu、C3H-nu、C57BL/6-nu等,裸鼠的解剖生理特点： 毛囊发育不良，外观上看几乎没有被毛，故称“裸鼠”； 无胸腺，仅有胸腺残迹或异常的胸腺上皮。故不能分泌胸腺素，不能使T细胞正常分化，而T细胞是移植排异的主要细胞。细胞基本正常但功

21、能欠佳。有较高的NK细胞数量和活性。 因为IgG的产生需要T细胞和巨噬细胞的参与，其免疫球蛋白主要是IgM，只有极少量的IgG。 自发肿瘤现象罕见，可能与NK细胞的活性高有关。 裸鼠易患鼠肝炎和病毒性肺炎。 纯合裸鼠母性极差，且受孕率低，乳房发育不良。通常以纯合雄鼠与带有nu基因的杂合雌鼠（nu/+nu/nu）可获1/2裸鼠。 裸鼠需饲养在屏障环境中,裸鼠的应用 （1）肿瘤学。 （2）微生物学。 （3）免疫学。 （4）寄生虫学。 （5）遗传学。 （6）遗传学。 （7）临床医学,2.裸大鼠 1953年，英国科学家首次在大鼠中发现一种外观与裸小鼠相似，只是被毛不像裸小鼠那样全无，通过解剖和免疫学检

22、查发现其也是无胸腺、缺乏T细胞功能，B细胞功能正常，细胞活力增强，繁殖方式与裸小鼠相同，且能接受异种组织和细胞移植,3.Beige（bg）小鼠 为NK细胞活性缺陷的突变系小鼠，bg是隐性突变基因，位于第13号染色体上。纯合的小鼠（bg/bg）被毛完整，但毛色变浅，耳廓和尾尖色素很淡。这种小鼠其内源性NK细胞功能缺陷。纯合bg基因降低杀菌活性。 bg对化脓性细菌感染非常敏感，对各种病原因子也都较敏感， bg小鼠必须在屏障环境中才能较好的生存。繁殖时可采用纯合子的亲本,4.SCID小鼠 SCID小鼠的全称为“重症联合免疫缺陷”小鼠。其突变点在16号染色体上，为单基因突变，突变符号为scid，当其纯

23、合时，性状表现为淋巴细胞抗原受体基因编码顺序异常，造成T、B淋巴细胞不能分化为特异性的淋巴细胞，目前已有多种不同品系的SCID小鼠,SCID小鼠的生物学特征： 外观与普通小鼠无异样，但其胸腺、脾、淋巴结等免役器官的重量不到正常小鼠的30%。其胸腺多为脂肪组织包围，没有皮质结构，仅残存的髓质。外周白细胞较少，淋巴细胞仅占总数的10-20%（正常小鼠为70%）。 饲养环境 SCID小鼠需在屏障环境（ 空气洁净度万级以下）中，方能存活一年以上。其繁殖生产，以近交系繁殖方式进行，产子率和离乳率均低于正常小鼠,5.Motheaten小鼠 突变基因（me）位于第6号染色体上，出生后两天内即可有病变现象，表

24、现为皮肤脓肿，有严重的联合免疫缺陷现象。对胸腺依赖和不依赖抗原均无反应，细胞毒和自然杀伤细胞活性低下。此小鼠对于先天性早期免疫缺陷和某些自身免疫疾病的研究有着重要的价值,6.人工定向培育的多联免疫缺陷型小鼠 目前，常见的三种小鼠的三个隐性免疫基因，即 NK细胞缺陷的Beige基因、T细胞缺陷的nu基因和B细胞缺陷的Xid基因。可将它们杂交- 回交，筛选出T、B、NK细胞三联免疫缺陷小鼠。这种小鼠对于实验性的肿瘤移植和免疫功能的研究有着极其重要的作用,转基因动物的概念,所谓转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，后改用注入受精卵的任何一个前核，并在细胞基因组中稳定整合，再将

25、合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（foster mother）的子宫内, 使之发育成具表达目的基因的胚胎动物, 并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。这类动物由于外源性目的基因的稳定存在而赋于子代动物个体,转基因动物技术的主要步骤,获取外源目的基因 外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物,目的基因的制备,目的基因的制备目的基因的获得 逆转录合成法 化学合成法 PCR扩增法目的基因的扩增 通过载体在宿主中克隆 通过PCR扩增目的基因,目的基因的导入,脂质体介导法

26、 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状结构 形成囊状结构可将DNA包在其中 带有外源DNA的脂质体通过细胞的内吞作用进入受体细胞，达到基因转移的目的 血影细胞介导法 血影细胞：哺乳动物细胞溶血，使血红蛋白大量逸出，最后成为仅有被细胞膜包被的细胞核结构 血红蛋白大量逸出时，外源DNA也容易进入。让血影细胞与受体细胞在适当条件下发生细胞融合，从而使外源DNA导入受体细胞 电转移法 受体细胞与外源DNA按一定比例混合后，放入电脉冲槽中，经用脉冲电压刺激，外源DNA即可进入细胞（或受精卵,目前应用于生产转基因动物的方法,原核显微注射 生殖细胞载体 反转录病毒转染 体细胞核移植 胚胎干细

27、胞技术,应用较早并且被公认和成熟的技术,最具应用潜力的并且也是目前发展最快的技术,原核注射,显微注射法是建立得最早的转基因方法，也是目前使用最为广泛、最为有效 的方法。其所具有的优点是:基因的转移率高，整合效率可达30%:可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移;外源基因的长度不受限制，可达几百kb;常常能得到纯系动物;实验周期相对比较短,外源基因,基因微注射,移植受精卵,小鼠出生,转基因鼠的检测,繁殖后代,A :准备注射的原核清晰的卵母细胞 B:注射过程 C: 注射后的卵母细胞 D: 吸取基因注射液,转GFP绿色荧光胚胎,转GFP绿色荧光胚胎,生殖细胞载体技术,有体外和体内转染生殖

28、细胞的两种方法，前者又包括精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注射法等。 精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。此法理论上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不稳定，有待继续探索、完善,反转录病毒转染,将目的基因重组到反转录病毒RNA载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前或着床后的胚胎,也可以让胚胎与能释放反转录病毒的单培养层细胞共孵育以达到感染的目的。反转录病毒RNA进入寄主细胞后,被反转录为DNA,并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下整合到寄主细胞的基因组进行表达和遗传,得到转基因动物,目的基因,

29、逆转录病毒,卵母细胞,成熟卵母细胞,精子,导入,感染,体外受精,囊胚,受体动物子宫,胚胎移植,转基因动物,妊娠,体细胞核移植,体细胞核移植技术是先把外源基因整合到供体细胞上,然后将供体细胞通过显微操作的方法注射到去核卵母细胞中,组成重构体,通过激活使其发育成转基因重构胚胎，再把其移植到假孕母体,待其妊娠、分娩后便可得到转基因克隆猪。此法具有相对较大的优越性:转基因效率高,约是显微注射法的2倍；可对外源基因在供体细胞上是否整合、整合状况及整合位点预先进行准确鉴定和评估；也可以提前预测基因的表达情况；不存在位置效应且能大大节省供体和受体动物的数量及费用,目的基因,动物胎儿成纤维细胞,卵母细胞受体,导入,注核,囊胚,受体动物子宫,胚胎移植,转基因动物,妊娠,成熟卵母细胞,去核,核移植获得的表达红色荧光蛋白的兔克隆胚,左图为光镜视野照片，右图为激发荧光的照片,核移植获得的表达绿色荧光蛋白的兔克隆胚,2007克隆出世界首例转基因克隆兔,Transgenic Res 18(2):227-35,2009 Apr (TRAGonline) doi:10.1007/s11248-008-92