荧光定量PCR引物设计原则

1、1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件 看看结果。2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。4.G+C含量在40%60%之间，45-55最佳。5.碱基要随机分布，尽量均匀。6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。8.引物5端可以修饰。9.3端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。10. 引物3端要避开密码子的第3位。11.引物整

2、体设计自由能分布5端大于3端，且3端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70或者有8个互补碱基同源。15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。16.TM值在58-62度之间。17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取

3、得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： 引物长度一般引物长度为1830碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。在引物长度小于20bp时：4(G+C)+2(A+T)-5在引物长度大于20bp时：62.3+0.41(%G-C)-500/length-5另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54的最短的引物可获得最好的效率和特异性。总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。

4、引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。 GC含量一般引物序列中G+C含量一般为40%60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5端加适量的A、T或G、C尾巴。 退火温度退火温度需要比解链温度低5，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差46不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在5575间变化。 避免扩

5、增模板的二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 与靶DNA的错配当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：/BLAST/。选择Align two sequences (bl2seq)，如

6、下图。BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。可是使用BLAST还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。 引物末端引物

7、3端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 引物的二级结构引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4

8、个连续碱基的同源性或互补性。 为了下一步操作而产生的不完全匹配5端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。a 添加限制性内切酶酶切位点添加酶切位点是将PCR产

9、物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5端还需要加23个保护碱基。但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：Sal不需要保护碱基，EcoR需要1个，Not需要2个，Hind 3个。其中，在原核表达设计引物时还有一些小技巧，大家可以参考：原核表达之实验前的分析。里面一些规则是所有表达都通用的。有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。不过这种方法虽然方便但并不推荐。有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。一旦出现问题，分析起来更麻烦。b

10、 LIC添加尾巴LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。用LIC 法制备的pET 载体有不互补的1215 碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。扩增目的插入片段的引物5序列要与LIC载体互补。T4 DNA 聚合酶的35外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。c 定向TA克隆添加尾巴在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。但是后来人们发现TA克隆无法将片段定向克隆到

11、载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有方向”了。d In-Fusion克隆方法这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的。此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长时间的反应。只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。这种方法特别适合大批量的转化。如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应，比如在加入Not的酶切位点后整

12、个引物的退火温度就会直线上升（它识别的是8个碱基，且全为GC），这样使另外一个引物的设计变得十分困难，因为一对引物间退火温度相差不宜太远。因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符合。在碰到这些情况的时候，我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则，要试一试才能知道能否行得通了表达不同于其它一些实验，比如：提取质粒、PCR、电镜切片，这些人为控制的因素比较多，出问题相对来说也比较好分析。表达呢，你把质粒克隆好啦，交给细胞，然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。原核表达在表达当中来说还是比较简单，细菌培养条件简单、生长速度快，需要的仪器和培养基都比较便宜。当然，它也存在一些缺乏高

13、级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。原核表达从一开始的设计就非常重要，所谓好的开始是成功的一半。做足准备功夫，可是省去很多将来后悔的事情。首先，我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类，如果希望可以同时尝试多种表达系统，也有许多商业化的系统供选择。前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系，现在我想先从自己的蛋白分析讲起。同样的载体、同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量奇高，但是另外一个就是做不出来，所以没有万能的载体，只有永恒的分析。当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的，选择同样的载体表达成功率会高很多。如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的

14、文献。比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。根据经验而言，含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。在下面将列出几个影响表达的因素，大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下：1.翻译起始位点现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了，一般情况下不需要自己再加，不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子2.GC含量表达序列中的GC含量超过70%的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite

15、等软件进行预测。3.二级结构在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用软件分析DNA或RNA结构上有柄(stem)结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定。4.基因或者蛋白的大小一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位(即单体蛋白)间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。对于另一个极端，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签，如6组氨酸标签。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可以利用软件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种数据统计的结论，如果