斑蝥临床应用及炮制研究.ppt

1、a,1,斑蝥临床应用及炮制研究,2010版中国药典饮片标准研究课题 中药饮片质量标准平台建设子课题,河南中医学院 张振凌 赵丽娜 王一硕 田连起 石延榜,a,2,概述,斑蝥入药始载于神农本草经，为芫青科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 的干燥体1。 辛、热；有大毒。具有破血消癥，攻毒蚀疮，引赤发泡的作用。 由于斑蝥素具有毒性，常引起临床中毒，从古至今均需要炮制,a,3,主 要 内 容,斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究,3,a,4,1.临床应用及药理研究,含有的斑蝥素(Cantharidin, C10

2、H12O4)具有较强的抗肿瘤活性，并且不降低白细胞，同时具有较强的刺激；是重要的皮肤发泡剂。因而具有重要的药用价值。 1.1、治疗癌症 斑蝥及提取物以及斑蝥素的衍生物等对治疗原发性肝癌疗效显著，明显优于手术治疗或放疗。 斑蝥及斑蝥素的衍生物对乳腺癌、食道癌、肺癌、贲门癌、肠癌、等也有一定疗效。 1.2、治疗神经性皮炎、疥癣、瘰疬 外用刺激皮肤发泡,a,5,2.药理研究,2.1抗肿瘤机制 斑蝥素及其衍生物，分子量小，易入细胞内，产生细胞毒作用，具有较强的抗肿瘤作用，作用机制主要有： 抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡； 抑制肿瘤细胞的侵袭和转移； 抑制癌细胞脱氧核糖核酸(DNA)复制，增加放

3、、化疗的敏感性。并且具有免疫增强和升高白细胞作用，这种独特的作用，早期可能由加速骨髓成熟或释放所致，后期则可能与促造血干细胞的增殖并向粒一单核系祖细胞不断分化有关。 2.2 抗纤维化和抗氧化损伤作用： 不同浓度的斑蝥素均能改变成纤维细胞的形态，抑制细胞增殖，成纤维细胞数目明显下降，形态变得不规则，排列混乱，代谢产物增加。从而证实斑蝥素能抑制NIH/373细胞的增殖，并且呈剂量依赖性。 2.3 抗炎、抗病毒、抗菌、促雌激素样作用,a,6,第二部分 斑蝥米炒炮制工艺的研究,05版中国药典规定米斑蝥的炮制方法为取净斑蝥与米拌炒，至米呈黄棕色，取出，除去头、翅、足,斑蝥为毒性中药，该炮制方法较为笼统，

4、仅靠颜色对炮制程度进行判断，没有量化具体的工艺参数，饮片企业很难按此生产出安全、可控、稳定的产品,根据传统的炮制经验，结合现代炮制设备，量化斑蝥米炒炮制工艺的参数，进行中试生产，制定SOP，符合中药现代化的要求,a,7,米斑蝥小批量生产工艺,米斑蝥中试生产工艺,米斑蝥标准操作规程SOP,入锅 温度 200,同时入锅炒制24min,米呈黄棕色、米斑蝥完好,红外测温仪,滚筒 内壁 温度 300,铁锅,电加热炒药机,大米炒制2min后， 入斑蝥炒制3min,a,8,米炒斑蝥SOP 1 适用范围 本标准适用于饮片车间生斑蝥、米炒斑蝥的操作。 2 职责 操作工：严格按本SOP进行生斑蝥、米炒斑蝥操作。

5、3 内容 3.1 生斑蝥、米炒斑蝥前的准备 3.1.1称量器具、红外测温仪、电热炒药机等处于完好、清洁状态，生产用具齐全。 3.1.2工作间压差、温度、相对湿度符合生产工艺要求。 3.1.3以上要求均满足后，方可生产。 3.2 领料 操作人员领取斑蝥、大米，核对品名、数量等。如有不符，严禁进入生产岗位，并按相关规定处理。 3.3 净制： 操作人员将斑蝥过2号筛，筛除杂质，去除头、足、翅，即为生斑蝥。 3.4 称量： 称取生斑蝥（除头、足、翅）250g, 根据生斑蝥每10kg用大米2kg，称取大米50g。 3.5 米炒： 将电热炒药机温度设定在400，开机，用红外测温仪监测滚筒内壁底温度，待滚筒

6、内壁温度升至300，立即投入大米，并开始计时，将大米炒2min后立即投入生斑蝥，继续炒制3min，停止炒制，立即出锅，此时大米为棕黄色，放凉。拣去大米。炒制过程共5min，用红外测温仪监测滚筒内壁温度范围在280-320。 3.6 称量：称重米斑蝥，计算收率。 3.7 包装：将米斑蝥定量包装，贴上标签，注明品名、批号、生产日期等。 3.8 清场：生产操作完毕，及时清场，将垃圾妥善处理，确保现场没有残留物,米炒斑蝥SOP,a,9,验证,由浙江中医药大学中药饮片厂生产出9批样品，说明本操作规程可行,a,10,第三部分 斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究,近年来相继有多篇文章 报道了采用HPLC法测定斑

7、蝥素含量,缺点：准确度不高，重现性差，使用不普及,建立斑蝥素的HPLC含量测定方法,a,11,斑蝥不同部位及米炒炮制前后斑蝥素含量比较研究,药材 大、小净斑蝥 根据大小斑蝥的特征进行挑拣，分档，除去杂质，其中一份除去头、足、翅，即为大、小生斑蝥。粉碎成粗粉，备用。 头、足、内外翅 因小斑蝥饮片的头、足、内外翅不易剥离，故选大斑蝥进行各部位的剥离，粉碎成粗粉，备用。 米炒斑蝥 取净斑蝥与米置锅内，用文火加热，拌炒至米呈黄棕色，取出，去米。每100g斑蝥，用米20g。规定药材温度110，加热2min。粉碎成粗粉，备用,a,12,斑蝥各部位重量比例表,a,13,含量测定结果,斑蝥中头足翅总重仅占28

8、.26%，而其所含斑蝥素在生品中占0.16%，且头足翅很难完全粉碎，临床不去头足翅易引起病人恶心呕吐，故可以认为其为非药用部位,通过比较可知，斑蝥素含量：生斑蝥饮片斑蝥药材米炒斑蝥。这说明米炒炮制使斑蝥中的斑蝥素含量减少，毒性降低，同时由于头足翅中斑蝥素含量较低，导致同等重量下斑蝥药材中的含量低于生斑蝥饮片中斑蝥素含量,南方大斑蝥和黄黑小斑蝥中斑蝥素含量相差不明显，故可将两者一起炮制,a,14,第四部分 斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究,文献报道认为芫菁科豆芫菁属、斑芫菁属昆虫中含有的斑蝥素分为游离和结合两部分，并且总斑蝥素远远高于游离斑蝥素的含量,05版药典规定的氯仿直接浸提法，没有得到总斑

9、蝥素的含量,结合斑蝥素在酸水解条件下还原为游离的斑蝥素,通过预试验，证明斑蝥中不仅含有氯仿浸提的游离斑蝥素，还含有酸水解提取的结合斑蝥素,药材及饮片中 总斑蝥素的研究,a,15,总斑蝥素提取方法的考察,0.5mol/LH2SO4溶液调PH至2左右,第一法,a,16,超声处理15分钟 静置26h,样品粗粉0.4g,三氯甲烷10ml,提取液,至分液漏斗,至蒸发皿,50水浴挥干,甲醇定容至5ml容量瓶,盐酸溶液（PH=1）10ml,氯仿萃取4次,静置26h,超声处理15分钟,a,17,结果 将上述四种方法所得供试品溶液，按色谱条件进样，计算各样品中总斑蝥素的含量,为使斑蝥素转移完全，对该法中三氯甲烷

10、的萃取次数及洗涤次数进行考察，结果表明，萃取五次和洗涤五次转移完全,按照该法对药渣进行提取，提取液中未检测到斑蝥素，表明提取完全,a,18,第四法正交设计实验考察,因素水平表,通过预试验，分别对盐酸PH值、超声功率、超声时间、三氯甲烷用量四个因素，选用L9（34）正交试验表对酸水解超声法提取工艺进行筛选优化,a,19,总斑蝥素提取方法L9（34）正交实验及实验结果,a,20,方 差 分 析 表,综合考虑确定总斑蝥素最佳工艺为：A1B2C2D1。即：取三氯甲烷和 PH=1的盐酸溶液各10ml，超声处理（功率100W，频率40kHz）15分钟,a,21,验证,分别取同批次斑蝥药材样品粗粉0.3g各

11、3份，精密称定，按优选的提取工艺提取总斑蝥素，结果得各批次含量的相对平均偏差为0.76%，证明总斑蝥素采用此提取工艺提取可行,斑蝥素是一种酸酐，能与体内的Na,Mg等金属元素结合，形成斑蝥素钠盐或镁盐等。这些斑蝥酸的结合物在酸性环境中能够游离出斑蝥酸或者斑蝥素，故采用酸水解的方法提取总斑蝥素,实验过程中发现斑蝥药材粉末总是在酸水层，不在氯仿层，故可以采用萃取的方式分取氯仿层提取液。并采用正交实验设计优选出总斑蝥素的提取工艺,a,22,斑蝥不同部位及米炒前后总斑蝥素含量比较研究,药材 斑蝥药材、米炒斑蝥及斑蝥头、足、内外翅部分样品同“第二部分实验3中样品,供试品溶液的制备,按照实验1中优选提取工

12、艺制备,色谱条件 流动相：甲醇水(23:77)， 流速1.0ml/min，检测波长230nm，柱温：30,精密称取斑蝥素对照品2.18mg，置2ml容量瓶内，少量甲醇超声使溶解后，加甲醇至刻度，摇匀，备用,对照品溶液的制备,a,23,含量测定结果,斑蝥中头足翅总重占28.2%，而其所含总斑蝥素占0.61%，含量较低，进一步证明其为非药用部位,通过比较可知，总斑蝥素含量：生斑蝥饮片斑蝥药材米炒斑蝥。与其斑蝥素含量趋势一致,这说明米炒炮制不但使斑蝥素含量减少，而且总斑蝥素含量也减少，推测结合斑蝥素的存在,a,24,第五部分 斑蝥药材及饮片质量标准研究,本次质量标准的制定，共收集斑蝥药材16批次，生

13、斑蝥10批次，米炒斑蝥15批次,经河南中医学院生药学科陈随清教授鉴定分别为芫青科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 的干燥体、去除头足翅及杂质的净制加工品或米炒炮制加工品,实验1.样品的收集与鉴定,a,25,斑蝥药材样品来源表,a,26,生斑蝥样品来源表,a,27,米炒斑蝥样品来源表,a,28,由于斑蝥是毒剧药材，临床用量较少，几乎所有中药饮片企业在申报GMP认证过程中均没有上报此生产品种， 由于每次炮制量太小，饮片生产企业无法用炒药机进行机械化生产，无法通过设备控制生产条件。 除浙江中医药大学饮片

14、厂生产的样品和河南中医学院炮制的样品，我们请各地中医药院校炮制教研室的专家教授们采购当地市售米炒品或采购生斑蝥自己加工炮制作为样品来源，但鉴于斑蝥是毒剧药不能随意购买，因此斑蝥的来源和数量受到了限制,a,29,斑蝥药材 南方大斑蝥 体型较大，呈长圆形，长1.52.5cm，宽0.51cm。头及口器向下垂，有较大的复眼及触角各1对，触角多已脱落。背部具革质鞘翅1 对，黑色，有3条黄色或棕黄色的横纹；鞘翅下面有棕褐色薄膜状透明的内翅2 片。胸腹部乌黑色，胸部有足3对。有特殊的臭气。 黄黑小斑蝥 体型较小，长11.5cm,南方大斑蝥 黄黑小斑蝥 伪品斑蝥,实验2.斑蝥药材及饮片性状、显微鉴别研究,性状

15、鉴别,a,30,大生斑蝥 小生斑蝥,生斑蝥 南方大斑蝥 体型较大，头足翅偶有残留。头部去除后的断面不整齐，边缘黑色，中心土黄色。有特殊的臭气。 黄黑小斑蝥 体型较小,a,31,米炒斑蝥 南方大斑蝥 体型较大，头足翅偶有残留。色乌黑发亮，头部去除后的断面不整齐，边缘黑色，中心灰黄色。质脆易碎，有米炒后的焦香气。 黄黑小斑蝥 体型较小,a,32,显微鉴别,刚毛 横纹肌纤维 复眼碎片,体壁碎片,气管壁碎片,主要特征,由于米炒斑蝥与生斑蝥、斑蝥药材均为动物昆虫，其基本组织相同，没有根本区别，显微鉴别很难区分，故没有收载显微鉴别项,a,33,因2005年版药典方法提取时间较长，取样量较多易出现脱尾等，故

16、对2005版药典TLC鉴别供试品溶液制备方法进行如下考察,对提取方法的选择,从左至右: 1、斑蝥素5ul； 2、3、2005药典法提取样品； 4、斑蝥素3ul 5、6、超声法提取样品,超声法时间短、更便捷，故采用超声提取法,实验3.斑蝥药材及饮片TLC鉴别,a,34,对取样量的选择,从左至右：1 、2、3 、4 3g样品；5、斑蝥素5ul； 6、7 2g样品,取样量为3g者，色谱中有拖尾现象，故将取样量减少为2g,a,35,对石油醚沸程的选择,从左至右：1、6、斑蝥素5ul；2、3、石油醚（6090）4、5、石油醚（3060,两种石油醚对斑蝥素斑点的分离度、拖尾情况均无影响，但石油醚（3060

17、）挥发性较好，故仍选用石油醚（3060,a,36,取本品粉末2g，加三氯甲烷20ml，超声处理（功率400W，频率40KHz）15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣用石油醚（3060）洗2次，每次5ml，小心倾去上清液，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液,供试品溶液的制备,取斑蝥素对照品,加三氯甲烷制成每1ml含5mg 的溶液，作为对照品溶液,对照品溶液的制备,a,37,考察了不同展距对薄层斑点的Rf值的影响，为使其适中故选择其展距为8cm,对展距的选择,展开,展开剂：三氯甲烷丙酮(49:1) 显色剂：0.1 溴甲酚绿乙醇溶液,a,38,TLC耐用性考察,薄层板的选择,分别对青岛海洋化工厂生产

18、的预制板（10*20cm）、手工铺制板（10*20cm）、手工铺制板（10*10cm）进行考察，各板薄层斑点的分离度及拖尾情况良好。因选择展距为6cm，故选用宽度为10cm的预制板,青岛海洋预制板 （10*20cm,手工铺板（10*20cm,手工铺板（10*10cm,a,39,湿度的考察,根据硫酸-水溶液相对湿度表，配制58.9%、26.2%浓度的硫酸水溶液，在密闭的干燥器中分别造成相对湿度为20%、80%的环境，在不同湿度下薄层斑点的分离度及拖尾情况良好,不同浓度的硫酸水溶液,20,36,80,a,40,温度的考察,分别在410（冰箱）、室温条件下展开，在不同温度下主斑点的分离度及拖尾情况良

19、好,a,41,斑蝥有芫青科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 两个品种，故对南方大斑蝥和黄黑小斑蝥两个品种样品分别进行鉴别,从左至右： 1、云南1斑蝥药材； 2、云南2 米炒斑蝥； 3、斑蝥素； 4、 生小斑蝥； 5、米炒小斑蝥； 6、生大斑蝥； 7、米炒大斑蝥,结果显示这两个品种的鉴别情况一致,多来源品种的鉴别,a,42,定性鉴别,精密吸取上述斑蝥药材、生斑蝥及米炒斑蝥各批样品的供试品溶液及斑蝥素对照品溶液各5l,分别点于同一硅胶G薄层板上。 以氯仿:丙酮(49:1)为展开剂，展开，展距6cm，晾

20、干，喷以0.1%溴甲酚绿乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。 供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的斑点,斑蝥药材定性鉴别（从左至右17为各批斑蝥药材 8为斑蝥素,a,43,生斑蝥定性鉴别（从左至右16为各批生斑蝥 7为斑蝥素,a,44,米炒斑蝥饮片定性鉴别 （从左至右110为各批米炒斑蝥 11为斑蝥素 1213为大、小斑蝥 1415为大、小米炒斑蝥,根据要求对TLC鉴别进行耐用性考察，其结果稳定，重现性高，故质量标准中均收载TLC鉴别项,但该TLC色谱条件下，仅显斑蝥素色谱点，成分较单一，无法区别斑蝥药材、生斑蝥与米炒斑蝥,a,45,按照中国药典附录 K灰分测定法对各批次样品进行总灰分

21、及酸不溶灰分测定,实验4.斑蝥药材及饮片水分、灰分和浸出物含量检查,按照中国药典附录 H水分测定法第三法减压干燥法对各批次样品进行水分的测定,按照中国药典附录A浸出物测定法中冷浸法测定各批次样品的水溶性浸出物、醇溶性浸出物,a,46,a,47,因斑蝥及米炒斑蝥为毒剧药材，不入汤剂多入丸散，且其有效成分斑蝥素易升华，在浸出物测定中，干燥过程使斑蝥素升华，因此，无论醇浸出物、还是水浸出物都不包含游离斑蝥素成分，故未对其浸出物的含量进行限度要求,斑蝥作为生长在植物叶片上的成虫，不易掺附杂质，并且经净制（去头足翅）和炒制后灰分含量没有明显改变，酸不溶性灰分含量有些降低但并不稳定，因而在质量标准中未将灰

22、分、酸不溶灰分的检查作为检查项目,斑蝥中所含斑蝥素具有升华性，84即开始升华，故无法用烘干法测定其水分；甲苯法要求样品量较多（取样量要约含有14ml水分，而米斑蝥为炒制品，水分含量较低，样品需要几十克）；由于是毒剧药，一般使用单位采购量、库存量均少，本次浙江中医药大学饮片厂所提供的三批样品，其中一批为100g，用甲苯法测定其水分含量样品量就显不足；气相法测定需要专门的仪器设备；最后选用减压干燥法测定各批次样品的水分含量，结果证明斑蝥中水分含量较低，但减压干燥法本身准确度不高，因此质量标准中均不设水分限度检查,a,48,色谱条件,对照品溶液的制备,精密称取斑蝥素对照品2.18mg，置2ml容量瓶

23、内，加甲醇至刻度，摇匀，备用,实验5.斑蝥药材及饮片斑蝥素、总斑蝥素含量测定,流动相：甲醇水(23:77)， 流速1.0ml/min，检测波长230nm，柱温：30,供试品溶液的制备,斑蝥素 取本品粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，用三氯甲烷作溶剂，超声处理（功率400W，频率40kHz）2次（30ml，30ml），每次15分钟，提取液滤过，用少量三氯甲烷分次洗涤容器，滤液和洗液滤入同一蒸发皿中，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀,即得,a,49,总斑蝥素 取本品粗粉约0.3g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，加三氯甲烷10ml,再加盐酸溶液（PH=1）10m

24、l，超声处理（功率400W，频率40kHz）15分钟，置分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷振摇提取5次（10ml,10ml,5ml,3ml,3ml），残渣和容器用三氯甲烷洗涤5次，每次3ml，合并三氯甲烷液，抽滤，容器用三氯甲烷洗涤5次，每次3ml，滤液和洗液置同一蒸发皿中，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定，即得,含量测定,供试品溶液的制备,a,50,a,51,根据以上实验测定结果，将斑蝥药材斑蝥素含量计算平均值，下浮20% 为0.51%，综合考虑规定斑蝥药材中斑蝥素含量限度标准为

25、不得少于0.50,生斑蝥因去除了重量近30%的头足翅，而头足翅斑蝥素含量又很低，因此斑蝥素含量升高，故规定其斑蝥素含量限度标准为不得少于0.65,将米炒斑蝥饮片斑蝥素含量计算平均值为0.54%，上浮20%，为0.65%，规定米炒斑蝥中斑蝥素应不得高于0.65、总斑蝥素含量计算平均值为1.42%，下浮20%为1.13%，综合考虑规定总斑蝥素以斑蝥素计不得少于1.0,a,52,a,53,第六部分 碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准的研究,采用低浓度的药用氢氧化钠溶液炮制斑蝥，可以使斑蝥素在虫体内转化成斑蝥酸钠，以达到降低毒性，保留斑蝥抗癌活性的目的，其作用优于米炒法。这也是利用了炮制辅料使毒性成分结构改

26、变，同时与毒性成分生成盐而使毒性降低的原理,实验1.碱制斑蝥饮片的制备及斑蝥素提取工艺研究,a,54,碱制斑蝥的制备 最优碱制方案为A2B2C3，即以6倍于原药材量的0.75%NaOH水溶液，5060浸渍6小时后低温干燥,实验因素水平表,a,55,样品粗粉0.4g,蒸馏水10ml,提取液,上清液,离心,70水浴 加热30min,酸液,至分液漏斗,至蒸发皿,50水浴挥干,甲醇定容至5ml容量瓶,氯仿萃取4次,0.5mol/LH2SO4溶液调PH至2左右,超声15min,振摇10min, 静置5min,超声法,振摇法,斑蝥素提取方法的考察,比较提取方法,结果表明超声提取效率最高,a,56,超声时间

27、的选择,超声法提取工艺的优化,超声次数的选择,浸渍时间的选择,a,57,洗液的选择,表明石油醚洗提取效率最高，但石油醚洗液中仍有斑蝥素的存在，故选不用洗液提取,超声法提取工艺的确定,通过单因素循环法对提取方法、提取次数、提取时间、浸渍时间和洗液进行了考察,确定最佳提取工艺为超声15min提取2次，不浸渍，不用洗液,a,58,Agilent HC-C18色谱柱（4.6250mm）, 流动相：甲醇水(30:70)， 流速1.0ml/min，检测波长230nm，柱温：30,实验2.HPLC法测定碱制斑蝥饮片中斑蝥素含量,仪器与材料,仪器 日本岛津LC-2010AT高效液相色谱仪,样品 实验室自制碱制

28、斑蝥三批,色谱条件,a,59,标准曲线的绘制 对照品溶液的制备 精密称取斑蝥素对照品1.32mg，置2ml容量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，备用,在1.3213.2g范围内线性关系良好，回归方程为 Y=47532X+7443.7，R2=0.9998,a,60,方法学考察,a,61,样品含量测定结果,含量测定,精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10l，按色谱条件进样，计算样品中斑蝥素含量,供试品溶液的制备,按照实验1中优选的提取工艺制备,a,62,斑蝥素标准品色谱图,碱制斑蝥中斑蝥素色谱图,以上结果证明，由于采用碱提法提取，斑蝥中总斑蝥素含量较高，斑蝥酸钠含量也大大高于游离斑蝥素含量。无疑碱制斑蝥既能最大限度地保留斑蝥素，提高抗肿瘤活性，同时又能降低毒性。是斑蝥炮制的较好方法,a,63,测定各种无机元素的含量，推测结合斑蝥素的存在形式,第七部分 斑蝥药材及饮片中无机元素比较研究,原子吸收法,a,64,分别取各批次样品粉末0.3g于消解罐中，精密称定，依次加入浓硝酸6ml，过氧化氢2ml，放入微波消解仪中，按微波消解程序表进行消解，待整个消解系统冷却后，取出消解罐，打开罐盖，用少量去