第二十一章_常用分子生物学技术的原理及应用-LT

1、第二十一章,常用分子生物学技术的原理及应用 The popular technology in molecular biology: principle and application,第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular hybridization & blotting technology,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形成杂化双链的这种现象。,一、分子杂交与印迹技术的原理,杂交

2、的原理实质是核酸分子的变性与复性过程,复性,RNA,DNA,（一）印迹技术,1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用,Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.,原始文献出处：,（一）印迹技术,1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用,琼脂糖分离的DNA片段 变性为单链 将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾 利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到NC

3、膜上，使之成为固相化分子。,载有DNA单链分子的NC膜可在杂交液与另一种DNA或RNA分子（探针）杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的DNA分子上，经检测分析可显现出杂交分子的区带。,2. 印迹(blotting)定义,将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。,3. 应用,广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测,4. 发展,电转移印迹技术、 真空吸引转移印迹等,（二）探针技术,探针(probe)的概念,用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA片段或RNA片段,探针的种类,寡核苷酸探针 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针,将探

4、针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。,探针技术的概念,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术 (Southern blotting),（二）RNA印迹技术 (Northern blotting),（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting),（一）Southern blotting,10SSC 转移缓冲液,Whatman滤纸,凝胶,Whatman滤纸,纸巾,玻璃板,重物,与探针同源杂交的基因DNA片段,基因组DNA,DNA酶切片段

5、,NC或尼龙膜,NC膜或尼龙膜,基因组DNA的定性与定量分析。 如对在基因组中特异基因的定位及检测等。 重组质粒和噬菌体的分析。,Southert blotting用途,放射自显影照片,（二）RNA印迹技术(Northern blotting),相同点：,Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc Natl Acad Sci USA,

6、 1977, 74(12):5350-5354,原始文献出处,名称相对于Southern blotting,转移的是RNA 转移前无需酶切 转移效率较高 变性方法,不同点,原理均为毛细作用。,（二）RNA印迹技术,Northern blotting 用途 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA 的表达水平。 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。,Northern blotting结果,由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟以上两种技术应用的越来越少,（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹),首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。,

7、与DNA和RNA印迹相似之处,蛋白质的转移只有靠电转移。 蛋白质的检测以抗体作探针。 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。,与DNA和RNA印迹不同之处,Western blotting应用,检测样品中的特异蛋白质的存在。 细胞中特异蛋白质的定量分析。 蛋白质分子的相互作用研究。,Western blotting应用,SDS-PAGE purified recombinant human CK2 subunit and its Western b

8、lotting,用已知的特异抗体检测目的基因蛋白,三种印迹技术的比较,斑点或狭线印迹 (dot or slot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA芯片技术 (DNA chip),其他印迹技术,DNA芯片,第 二 节 PCR技术的原理与应用,（Polymerase Chain Reaction，PCR）,聚合酶链反应,PCR技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis建立的体外扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。,PCR方法被美国Science杂志评为

9、1989年的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被评选为象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry,Michael Smith,1944 -,1932 - 2000,La Jolla, CA, USA,Kary B. Mullis,University of British Columbia Vancouver, Canada,for his

10、invention of the polymerase chain reaction (PCR) method,for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、PCR技术的工作原理,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR体系基本组成成分,P

11、CR反应循环,变性 95C左右,延伸 适温,退火 Tm-5C,经过30个左右的循环后，PCR的扩增倍数为(1+x)n, x=75%, n为循环数.,2. 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。,3. 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。,4. 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因。,1. 与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。,二、PCR技术的主要用途,（一）目的基因的克隆,（二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析,二、PCR技术的主要用

12、途,三、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术 (RT-PCR) （二）原位PCR技术 (ISP) （三）实时PCR技术 (real time PCR),RT-PCR技术,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,DNA聚合酶,PCR,扩增出大量的产物,实时PCR技术原理,第 三 节核 酸 序 列 分 析Nucleic acid sequence analysis,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法 (M

13、axam-Gillbert法)-略,DNA链的末端合成终止法 (Sanger法),(Sanger双脱氧链终止法),HO P O P O P O CH2,O,A, C, G or T,1,3 ,OH,5 ,双脱氧核苷三磷酸,脱去,二、DNA链末端合成终止法,Sanger 1958年和1980年两次获Nobel奖,The Nobel Prize in Chemistry 1980,for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA,fo

14、r their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids,Paul Berg,Walter Gilbert,Frederick Sanger,1/2 of the prize,1/4 of the prize,1/4 of the prize,Stanford University Stanford, CA, USA,Harvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USA,MRC Laboratory of Mo

15、lecular Biology Cambridge, United Kingdom,1926-,1932-,1918-,三、DNA自动测序,用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。 用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。 通过4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,ABI PRISM 310型 DNA测序仪,主要用于DNA序列分析 (包括DNA测序,卫星序列、杂合子序列和三联体序列分析，单链构象多态分析,长片段PCR分析)，遗传

16、疾病诊断，亲子鉴定等,PE 3700型DNA测序仪,DNA序列测定(双脱氧法),PE 377型 DNA测序仪,DNA自动测序结果举例,基 因 文 库Gene Library,第 四 节,基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library),基因文库 (gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,第 五 节 生 物 芯 片 技 术,Biological chip technology,DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip) 指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧

17、密排列固定于单位面积的支持物上。,一、基因芯片(gene chip),将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质芯片(protein chip),第六节,生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,一、蛋白质相互作用研究技术,酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选,常用蛋白质相互作用的研究技

18、术,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。,（一）标签蛋白沉淀,标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。,标签融合蛋白沉淀实验流程示意图,（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途,酵母双杂交系统的应用,证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用

19、蛋白质。,电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。,二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术,（一）电泳迁移率变动测定,凝胶迁移实验结果示意图,凝胶迁移实验结果图,染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作

20、用的主要方法。,（二）染色质免疫沉淀法,染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图,第 七 节遗传修饰动物模型的建立及应用,The establishment and application of heredity-modified animal model,转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,转基因被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) 目的基因的受体动物,一、转基因技术,核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。,二、核

21、转移技术,有目的去除动物体内某种基因的技术, 称为基因剔除（gene knock-out）或基因靶向灭活(gene targeting)。,三、基因剔除技术,四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用,建立动物模型 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) 多基因决定疾病模型,第八节,疾病相关基因的克隆与鉴定 Cloning and Identification of Disease Relative Genes,功能克隆(functional cloning) 定位克隆(positional cloning),克隆疾病相关基因的策略,定义

22、从对一种致病基因的功能的了解出发来克隆该致病基因。,（一）功能克隆,应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。,利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 用不同人的DNA片段转化与人类遗传疾病具有类似表型的突变酵母，可以恢复(rescue)正常表型的片段中所含有的基因即可能为致病基因。这种实验称为功能互补试验 (functional complementation assay)。,（二）定位克隆,定义 从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。,系统的定位克隆工作 遗传学分析(确定致病基因染色体定位) 交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析 染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆,基因诊断和基因治疗,第九节,Gene Diagnosis and Gene Therapy,定义 直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。,一、基因诊断(Gene Diagnosis),DNA序列分析,用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断 。,PCR技术,快速检出样品中的痕量病原微生物。 微量DNA 样品中的基因及基因变异分析。 用于个体识别、亲缘关系鉴定、器官移植术前组织配型、基因连锁分析等等。,样品中痕量病原微生物的迅速检出、分类及