致病性弧菌增菌培养基和选择性鉴别培养基的研究

1、密级:公开中图分类号 :TS207.4声浮二商砍事硕士学位论文论文题目:作者性名:学科专业:研究方向:指导教师:提交日期:二。一0年一月 DissertationSubmittedtoZhejiangGongshang UniversityforMaster， 5DegreeofEngineering studesonEnrichmentMediumandSeleetiveDilferential MediumofPathogenie巧brio Author:KeminShen Major:FoodScience SuPervisor:Prof.GuangyingZhaoJan.2010 Co

2、llegeofFoodSeieneeandBiotechnologyEngineering， ZhejiangGongshangUniversityHangzhou，310035，P.R.China浙江工商大学硕士学位论文致病性弧菌增菌培养基和选择性鉴别培养基的研究摘要致病性弧菌(pathogenic巧brio)属于弧菌属(genus巧brio)，有12个种，包括霍乱弧菌(巧 brioeholerae)、副溶血性弧菌(巧brio那rahaemolyric。)、创伤弧菌(巧 briovuln沪eus)、海鱼弧菌(巧 briodamsela)、拟态弧菌(巧 briomi，ieus)、辛辛那提弧菌(

3、巧brioc万nc万nnariensis)、梅氏弧菌 (Vibriometschnikovi万)、霍利斯弧菌(巧 brioholl才sae)、河流弧菌(Vibrioj7uvialis)、弗尼斯弧菌(巧briofurnissii)、溶藻弧菌(巧brioa勿n口lylicus)和鳖鱼弧菌(巧bri口carchariae)。致病性弧菌是影响水产品安全的重要因素，通常存在于近海海水、海底沉积物、浮游生物、海产品(鱼类和贝类)中，是夏秋季沿海地区引发食物中毒的首要病原菌。人类多因食入未煮熟的海产品或污染此菌的盐渍食物而感染;主要症状为腹痛、腹泻、呕吐和发热等。如果不及时治疗，可能会危急生命。选择性鉴别培

4、养基是在生化反应的基础上开发的技术，它将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，使得检测结果直观，易于观察辨别，且具有低成本、特异性强、灵敏度高和检测快速、操作方便等优点。选择性鉴别培养基是国内外微生物检测发展的一个主要发展方向。目前，致病性弧菌仅有副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌具有选择性鉴别培养基，其它致病性弧菌尚没有。本研究的目的和意义是设计和研制其它致病性弧菌的选择性鉴别培养基，以满足和储备日益严格的食品安全标准和不同检测条件的需求。浙江工商大学硕士学位论文本论文主要围绕以下几个方面开展了一些工作:1致病性弧菌增菌培养基及培养条件的改进研究本试验对弧菌增菌培养基(VEM)及培养条件进行

5、改进研究，经过优化，获得一套适用于致病性弧菌增菌的VEM及培养条件。试验结果表明:以副溶血性弧菌为代表，用vEM在(36士l)“c+摇床 120r/min+2层牛皮纸封口条件下增菌培养，在相同时间内，其增菌菌液浓度是GB厅4789.7一2008中规定方法的碱性蛋白炼水(APw)增菌菌液浓度的 1.8士0.6倍;对12中致病性弧菌进行的增菌培养试验结果表明，VEM能有效促进12种致病性弧菌的生长繁殖。VEM组成为:混合蛋白陈2%(胰蛋白陈:鱼蛋白陈为1:3)、酵母浸膏0.2%、Nacl3%、pHS.6。这为后续工作的顺利开展奠定了基础。2创伤弧菌选择性鉴别培养基的研制本试验以创伤弧菌特有的酶系统

6、及其代谢特点和对某些特定抑菌成分的抵抗力为基础，设计研制了创伤弧菌选择性鉴别培养基(vvDM)。试验中对VvDM的显色效果、平板效率、灵敏度和特异性进行评价。结果显示:VvDM对创伤弧菌具有较好的选择性和特异性;用vvDM在 39OC培养 16h佗4h，创伤弧菌菌落为黄色;其它各种弧菌及非弧菌属致病菌菌落呈绿色或未形成有效的可见菌落;vvDM对创伤弧菌的出菌效率与嗜盐琼脂相比为 (92.42士3.43)%;检出限为10c创mL;因此，vvDM对海产品中创伤弧菌分离鉴别与检测是可行的，且具有操作简便、经济、结果易于观察等优点。3拟态弧菌选择性鉴别培养基的研究本试验以拟态弧菌特有的酶系统及其代谢特

7、点和对某些特定抑菌成分的抵抗力为基础，设计研制了拟态弧菌选择性鉴别培养基 (VInDM)。试验中对浙江工商大学硕士学位论文VlnDM的显色效果、平板效率、灵敏度和特异性进行评价。结果显示:37培养24h时，VlnDM对拟态弧菌具有较好的选择性和特异性;拟态弧菌菌落为绿色或蓝绿色，其它弧菌菌落呈黄色或没有有效菌落形成;VmDM对拟态弧菌的出菌效率与嗜盐琼脂相比为(90.1士6.8)%;检出限为IOZc创mL。因此，VI五DM对海产品中拟态弧菌分离鉴别与检测是可行的，且具有操作简便、经济、结果易于观察等优点。4辛辛那提弧菌选择性鉴别培养基的研制本试验基于辛辛那提弧菌特有的综合酶系统及其代谢特点和对

8、某些抑菌剂的抵抗力，设计开发出辛辛那提弧菌选择性鉴别培养基(VciDM)。试验中对VciDM的显色效果、平板效率、灵敏度和特异性进行评价。结果显示:37oc培养16h一24h，vciDM对辛辛那提弧菌具有较好的选择性和特异性;辛辛那提弧菌菌落为黄色，其它致病菌菌落呈绿色或没有有效菌落形成;VoiDM对辛辛那提弧菌的出菌效率与嗜盐琼脂相比为(82.14士4.45)%;检出限为101cfu/mL。因此，VciDM对海产品中辛辛那提弧菌分离鉴别与检测是可行的，且具有操作简便、经济、结果易于观察等优点。5海鱼弧菌的选择性鉴别培养基的研制本试验以海鱼弧菌特有的综合酶系统及其代谢特点和对某些抑菌剂的抵抗力

9、为基础，设计开发出海鱼弧菌选择性鉴别培养基(vdDM)。试验中对VdDM的显色效果、平板效率、灵敏度和特异性进行评价。结果显示:37oC培养16h一24h，vdDM对海鱼弧菌具有较好的显色效果、平板效率、选择性和特异性;海鱼弧菌菌落为绿色:其它致病菌菌落呈黄色或未形成有效的可见菌落;VdDM对海鱼弧菌的出菌效率与嗜盐琼脂相比为 (83.46士3.42)%;检浙江工商大学硕士学位论文出限为10，c创mL。因此，vdDM对海产品中海鱼弧菌分离鉴别与检测是可行的，且具有操作简便、经济、结果易于观察等优点。VEM分别与四种选择性鉴别培养基结合检测目标致病性弧菌的方法与常规方法(TCBs结合法国梅里埃细

10、菌鉴定系统 API20E试剂条或弧菌科生化鉴定管)相比，结果直观，易于观察，减少了溶藻弧菌等常伴菌的干扰，省去了TCBS分离培养后的生化试验，降低检测成本，减少工作量，操作简便，具有更高的检测效率和鉴别能力。关键词:选择性鉴别培养基;致病性弧菌;快速检测;创伤弧菌;拟态弧菌;辛辛那提弧菌;海鱼弧菌浙江工商大学硕士学位论文 STUDESONENRICHMENTMEDIUMANDSELECTIVE DIFFERENTIALMEDIUMOFPATHOGENICABSTRACTPathogenie巧 briobelongingtogenus巧brio， whiehhas12sPeeies，inelud

11、ing巧 briocholerae，巧 brioParahaemolyticus，巧 briovuln沪cus，巧 briodan，sela，巧briomimzc璐，巧 briocincinnatiensjs，环 briometschniko飞，11，巧 brjoholljsae，巧brioj7uvialfs，巧br才 0furnissj万，巧br才oa匆nolyr万 cusand巧br泛 0earchariae.Pathogenie片 brjo15oneoftheimPortantfactorsinfluencingAquaticsafety.AsatyPeof haloPhiliebaet

12、eria， itusuallyexjstsinoffingseawater， seabedsediment，Plankton， andseafood(fishandseashell).Pathogenie巧br才 015thePrimaryPathogenthat causesfoodPoisoninginlittoralduringsulll刀 lerandautulnn.PeoPlecouldbe infectedmostlybecauseofuncookedseafoodorPickledfoodwhicharecontan卫 natedbyPathogenic片b八 0.ThePrim

13、arysylnPtomsarebellyaehe，diarrhea，vo而t， feverand50on.LifewillbeindangerifthePatientcouldn tbetreatedintilne. SeleetiveDifferential一nedia， whieh15basedonbiochemicalreaetion，isa detectionteehnology.Ithassuceessfullyeombinedthereactionofbioehe而stryV浙江工商大学硕士学位论文 andtheti aditionalseParationofbiochemistr

14、yofbacterium， whieh15easyto observetheresultofdeteetion.Inaddition， therearesorneadvantages一 loweost， highsensitivity， sPecifieityandraPidness.SeleetiveDifferentialmedia15beeo而ng themaintrendof而 crobialdetection.AtPresent，only巧 brjoParahae脚olyticus， Vibriocholeraeand巧 briovuln沪 cushasaselectivediffe

15、rentialmediuln.butotherPathogenie巧 brionotyet.ThePurposeofthisstudy15todesignSeleetiveDi月七 rentialMediumfortherapidseParatio几 identificationanddeteetionofotherPathogenic巧brio， tomeettheneedsoftheinereasinglystringentfoodsafety standardsanddifl七 renttesteonditions. TheresearchescarriedoutinthisPaperw

16、ouldbedescribedasfollows: 1.Studyonenriehmentmediumandeul加 reconditionsofPathogenie阵brioThisl esearchoPt而让ed巧brioe而 chmentmediumandcultureconditionsin ordertoobtainamethodforenriehingvibrio， Theresultsshowedasfollow， taking巧 brzoParahaemolytieusforexamPle， theextractofthemyceliawhichhadbeen cultUred

17、on巧 brloeultureInediumsealedbyDouble一 LayerKxaftPaPerinshakecondition(36土l)。C， 120r/min15(1.8士 0.6)timesthanthatofthemyeeliaeultured onAPW(GB/T4789.7一 2008)underthesamecondition.Theresultof12Pathogenie巧 brjoenriehmenttestshowedthat，巧brioe而 chmentmediumean effeetivelystimulatethegrowthandreProduction

18、of12PathogenicVibr才0.娇brio em-ichmentmediu一 n15eomPosedof仰 Ptone0.5%， fishPePtone1.5%，yeastextl aet0.2%，NaC13%， PH8.6.F叭 herexPerimentcouldbesuccessfullyc田Tied onwiththesuPPortoftheabovework. 2.studyonVibrio vulni6cusDi亩 TcrentialMediunlV1浙江工商大学硕士学位论文 BasedonthesPeeifieenZymesystemsandthecorresPondi

19、ngmetabolismsof巧 briovuln沪cus， accordingtotheresistibilitytodifferentantibacterialingredients， VvDMwasdesignedfortheraPidseParatio几 identifieationordeteetionofVibriovuln沪 eus.Thetestsofcoloreffects， Platingefficiency， sensitivityandsPecificity wereeonductedtoevaluatetheefficiencyofVvDM.Theresultssho

20、wedthat: VvDMhadgoodselectivityandsPeeifieityfor巧 briovuln功 cus.Afterineubating for16一 24hat39“C，the巧 briovuln沪 cusformedyelloweoloniesonVvDM.The otherstrainsdidnotformcoloniesorformgreeneolonies.VvDMshowedamean Platingefficieneyof巧 briovuln沪 cuseellsof(92.42士 3.43)%anditsdeteetion11而t was10cfi刀mL，A

21、ccordingly， VoM15usefultodetect巧 briovuln功 cusforkinds ofinsPectionageneieswiththestrengthensofeasily一operated， lowereost， eonvenieneeforobservationand50on.3.5加 dyonVibriomimieusDifferentialMedium BasedonthesPeeificenZymesystemsandtheeorresPondingmetabolismsof巧 brjomjmicus， aecordingtotheresistibili

22、tytodifferentantibacterialingredients，VI宜 DMwasdesignedfortherapidseParatio几 identifieationordetectionof片brio mjmieus.Thetestsofeoloreffects， Platingefficieney， sensitivityandsPecifieity wereeonductedtoevaluatetheefficiencyofVlnDM.Theresultsshowedthat: VmDMhasgoodseleetivityandsPecifieityfor巧 brjomi

23、micus.Afterineubating for24hat37“C，the巧 briomimicusformedgreeneoloniesonVmDM.Theother strainsdidnotformcoloniesorformedyellowcolonies.VlnDMshowedamean Platingeffieieneyof片 briomimieuseellsof(89.80士 3.43)%anditsdeteetion11而t was102cfi刀InL.Aeeordingl又vlllDM 15usefulVll forkindsofinsPeetionagenciesto浙江

24、工商大学硕士学位论文detect巧 briomimjcuswiththestrengthensofeasily一operated， lowereost， convenienceforobservationand50on. 4.StudyonVibrioeineinnatiensisDifferentialMedium BasedonthesPecificenZymesysternsandthecorresPondingmetabolismsof巧 briocincinnarie脚is， accordingtotheresistibilitytodifferentantibacterialing

25、redients， VciDMwasdesignedfortherapidseParatio几 identificationor detectionof巧 briocincinnatiensis.Thetestsofeoloreffects， Platingeffieieney， sensitivityandsPecificityweredonetoevaluatetheefficiencyofVe泊M.The resultsshowedthat:VeiDMhasgoodseleetivityandsPeeificityfor巧brio cineinnaliensis.Afterineubat

26、ionfor16一 24hat37OC，The片 briocincinnatiensis formedyellowcoloniesonVeiDM.Theotherstrainsdidnotformcoloniesor formedgreencolonies.VciDMshowedameanPlatingefficiencyof巧brioc， ncinnariensiscellsof(82.14士4.45)0， 0anditsdeteetion一i而 twas10c允/毗.Accordingly， VciDMcineinnaliens万 5with 15usefulforkindsofinsPe

27、etionageneiestodetect巧brjo thestrengthensofbeingeasily一oPerated， lowereost， eonvenieneeforobservationand50on.5.5加 dyonVibriodamselaDifferentialMedium BasedonthesPeeificenzymesystemsandthecorresPondingmetabo!ismsof竹brioda胡sela， accordingtotheresistibilitytodifferentantibaeterialingredients， VdDMwasde

28、signedfortherapidseParation， identifieationordeteetionof片briodanz、 elaThetestsofcolore价cts， Platingeffieiency， sensitivityandsPeeificitywel一 edonetoevaluatetheefficieneyofVdDM.Theresultsshowedthat:VdDM hadgoodselectivityandsPeeificityfor巧 briodamsela.Afterincubationfor16一24V川浙江工商大学硕士学位论文 hat37“C，the

29、巧 briodamselaformedgreeneoloniesonVdDM.TheothersPecies ofbaeteriadidnotformcoloniesorformedyelloweolonies.VdDMshoweda meanPlatingefficieneyof巧brio由 mselaeellsof(83.46士 3.42)%anditsdetection11而 twaslolc细毗.Accordingl丫 vdnM15suit汕le几 rkindsofinspection agenciestodetect巧 briodamselawiththestrengthensofb

30、eingeasily一oPerated， lowereost， convenienceforobservationand50on. ComParedwiththeconventionalmethods(TCBSeombinedwiththeAPIZOE systemorbioche而 stryassessorofVibrionaceae)，巧 brioenrichmentmedium15 combinedwithfourSeleetiveDifferentialmediasresPectively， whieheanbeused toisolateanddeteetPathogenie巧bri

31、o.Meanwhile， iteanbeideniifiedwith severaladvantages:easily一oPerated，econo而cal， eonvenientforobservation.high sensitivityandsPecifieity. KEYWORDS:SelectiveDifferentialMedium;Pathogenie巧 brio;Rapiddetection;巧 briovuln沪cus;巧brion，imicus;巧 briocincinnatiensis;巧 briodamselalX浙江工商大学硕士学位论文目录第1章绪论.”._-”.-.”.-“.，.“”.“_”二”.“”二”“_.11.1食品安全与细菌性食物中毒.!，.，.1 1.2几种重要致病性弧菌的危害及其检测现状.l1.2.1创伤弧菌.创伤弧菌及其危害.，.创伤弧菌的检测现状.，.现有检测方法存在的不足.，.，.，.1.2.2拟态弧菌.拟态弧菌及其危害.，.，.，拟态弧菌的检测现状二，.、5 现有检测方法存在的不足.，.，.，二51.2.3辛辛那提弧菌.6 1.2.3