临床检验仪器学：全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪

1、第十四章 DNA/蛋白质测序仪, 45岁，女性，乳腺癌，双侧 ER,PR阴性 HER-2阴性,如何确定BRCA基因上的碱基排列？, 确诊为HOBC 对亲属进行相关的风险评估,CONTENTS,01,背景,02,DNA测序仪及其应用,03,蛋白质测序及其应用,目录,CONTENTS,01,DNA测序仪及其应用,02,蛋白质测序及其应用,目录,DNA测序的发展历程,DNA测序用于确定目标DNA上片断上的碱基排列顺序； DNA测序是分子生物学过程一项非常重要的内容，在疾病诊断、基础研究的过程中起着非常重要的作用； 人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)完成后，测序技术已经

2、成为现代医学的基础。,第一代测序 以化学降解法和末端终止法，具有片段长，准确性高的优点，代表公司ABI，贝克曼,第二代测序 目前应用广泛，通量高，代表公司Illumina以及Thermo Fisher,第三代测序 以纳米孔单分子测序技术为代表，无需要PCR,第一代测序,一、第一代测序技术,测序 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 优点：操作简单、安全、快速、准确,无3 OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入,T,C,G,退火,延伸/终止,变性,DNA模板,引物,测序酶,ddNTP,dNTPs,ddNTP 被加到正在合成的链上，由于它的3-OH已被氧化，下一个d

3、NTP的5-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止 测序反应的延伸阶段，ddNTP在不同位置掺入产生一系列不同长度的新的DNA片段,二、第一代测序技术检测方法,三、荧光标记测序法,三、荧光标记测序法,四、荧光标记底物法测序法,确定一条染色体片断上的碱基顺序，是金标准。 Sanger法： 在PCR时加入荧光标记的复制终止剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基） ddX的两个作用： 可以当作正常碱基参与复制 一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接 毛细管电泳 谁终止，碱基就是谁,PCR后产物的检测仪器 全自动DNA测序仪,平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于

4、0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳 毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中（内径50m100m），在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片段的快速分离,五、荧光标记底物自动测序仪,310 3130 3130 xl 3500 3500 xl 3730 3730 xl,1 4 16 8 24 48 96,主机,分析软件,计算机,耗材,六、自动测序仪的结构,Anode Buffer(+),Pump assembly,(-),检测区,凝胶区块,自动进样器,七、自动测序仪的结果,八、毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护,电泳时仪器显示无电流 电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细

5、管 电极弯曲而无法浸入缓冲液中 毛细管未浸入缓冲液中 毛细管内有气泡等 电极弯曲 安装、调整或清洗电极后未进行电极定标操作就直接执行电泳命令，电极不能准确插入各管中 运行前未将样品盘归位、或虽然执行了归位操作，但X/Y轴归位尚未结束就运行Z轴归位等,电泳时产生电弧 主要原因是电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积 其他 测序结束后应将毛细管负极端浸在蒸馏水中，避免凝胶干燥而阻塞毛细管 定期清洗泵块 定期更换电极缓冲液、洗涤液和废液管,电泳时仪器显示无电流 电泳缓冲液配制不正确 电极导线未接好或损坏 正极或负极铂金丝断裂 正极或负极的胶面未浸入缓冲液中 传热板粘住胶板 主要原因为上方的缓冲液室漏液

6、,第二代测序之半导体测序法,Multi-Gene,Whole Exome,Whole Genome,Single Gene,Complexity,Sanger Sequencing,NGS,NGS,NGS,一、半导体测序法(Ion Torrent测序),芯片上千万个DNA 片段同时 读取序列信息,检测流程,复杂的生物信息学分析,第二代测序之边合成边终止法,第一个碱基结合,Cycle 1:,检测光信息,切掉终止子和染料,Cycle 2-n: 循环 (Repeat),边合成边测序,DNA(0.1-1.0 ug),Library preparation,Cluster generation,1,2,

7、Image acquisition,Sequencing,Library Preparation 制备文库,Sequencing 测序,Data Analysis 数据分析,4,3,1,第三代测序-pacbio,感染性疾病的分子诊断和研究 遗传性疾病的分子诊断和研究 恶性肿瘤的分子诊断和研究 在分子生物学其他领域的应用,CONTENTS,01,背景,02,DNA测序仪及其应用,03,蛋白质测序及其应用,目录,一、蛋白质自动测序仪,蛋白质顺序指肽链中氨基酸的排列顺序 通常从左至右表示肽链从氨基酸氨基端（N末端）到羧基端（C末端） 蛋白质测序仪工作原理：执行全自动化的Edman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程,多肽链N末端NH2 PITC,弱碱,苯异硫甲氨酰肽,TFA,噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物 剩余多肽,弱 碱,苯异硫甲氨酰肽,TFA,噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物 剩余多肽,PTH氨基酸,PTH氨基酸,HPLC,HPLC,二、蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能,测序反应系统 主要部件为反应器 氨基酸分析系统 由高效液相色谱毛细管层析柱组成 信息软件处理系统 根据氨基酸的层析峰来判断为何种氨基酸,三、蛋白质测序仪的主要应用,新蛋白质的鉴定 在凝胶电泳中出现的未知条带可以利用蛋白质测序仪来测定其序列 分子克隆探针的设计 用蛋白质序列信息设计PC