细胞工程：2植物人工繁殖

1、1,第2讲 植物人工繁殖,2,本节主要内容 1、组织培养再生植物 2、人工种子 本节重要问题 1、细胞全能性、细胞分化与脱分化 2、激素在细胞分化中的调节作用 3、植物经组织培养的再生途径,3,基本概念：细胞全能性细胞分化脱分化再分化,4,1细胞全能性,细胞全能性(totipotency)：指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。 1902年，德国植物学家哈伯兰德(Haberlandt)提出了细胞全能性学说，预言植物细胞具有全能性。 细胞全能性首先在植物中被证实。1958年，史都华德（Steward）等利用胡萝卜根韧皮部组织培养出了

2、完整的新植株，证明高度分化的植物营养组织仍保持着发育成完整植株的能力，以无性繁殖方式繁殖后代。 1960年，Morel提出了离体无性繁殖兰花的新方法，其繁殖系数之高，可谓始料不及，于是很快被兰花生产者所采用，从而在西方迅速建立起了“兰花工业”。可以说，这是植物组织培养技术第一次在园艺作物上形成规模化的生产应用。,5,2 细胞分化,细胞分化（Differentiation）是指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。 时间上的分化是指一个细胞在不同的发育阶段可以形成不同的形态和功能； 空间上的分化是指同一种细胞由于所处的环境或部位不同可以形成不同的形态和功能。细胞分化能

3、力的强弱称为发育潜能。 细胞分化与形态发生（Morphogenesis）是相互联系在一起的。形态发生是指通过细胞增殖、分化和行为塑造组织、器官和个体形态的过程。,6,细胞分化的实质是基因的差异表达,细胞分化的实质是基因的差异表达（Differential expression）, 是奢侈基因按照一定顺序表达的结果。 一些特定奢侈基因表达的结果生产一种类型的分化细胞。 在基因差异性表达中包括结构基因和调节基因的差异性表达，差异表达的结构基因受组织特异性表达的调控基因调控。,7,3细胞脱分化,脱分化（Dedifferentiation）又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞

4、特性的过程，即分化的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。 不同生物的细胞脱分化能力不同，通常采用人工诱导技术诱导体细胞的脱分化。不同生物的细胞脱分化能力不同，决定了组织培养再生的难易。,8,脱分化后的植物细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团（原始胚样组织），称之为愈伤组织（Callus）。它具有再分化成为完整植物体的潜能。,愈伤组织,9,4 细胞再分化,再分化（Redifferentiation）是指在离体条件下，无序生长的脱分化的细胞在适当条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。细胞再分化过程事实上是基因选择性表达与修饰的人工调控过程。 再分化是再生

5、的基础。离体培养植物组织或细胞再生植株就是通过细胞脱分化和再分化实现的。 脱分化是细胞全能性表现的前提，再分化是细胞全能性的最终体现。,10,植物人工繁殖：通过无性繁殖实现植物快速繁殖 方法：组织培养、人工种子、胚胎培养,目的：为克服自然有性生殖的不足，满足对优良植物的大量需求,11,二 植物组织培养再生,植物组织培养（Plant tissue culture）是将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。 愈伤组织：指由植物的一种组织或器官经历脱分化形成的原始胚样组织，它具有再分化成为完整植物体的潜能。 外植体（Expla

6、nt）:主要指用于离体培养的植物或组织切段。可以是器官、组织、细胞和原生质体等。 继代培养:愈伤组织在培养基上生长一段时间后营养物枯竭，水分散失，并已经积累一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上。,12,植物组织培养的优点,13,十字花科甘蓝种植物,14,http:/www.lanmei.cc/,15,5 脱病毒植株,很多农作物都带有病毒，尤其是无性繁殖植物，如马铃薯、甘草、草莓、大蒜等。病毒积累，危害加重。 植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒。因为该区无维管束，病毒难以进入，所以茎尖培养成为获得无病毒植株的重要途径。,16,17,18,植物组织培养的应用,1.快速繁殖：例如一

7、株兰花一年可以繁殖到400万株。 2.种苗脱毒：可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉等。 3.突变育种：可以直接诱变筛选出具抗病、抗盐以及高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。 4.基因工程育种：基因转导后通过组织培养途径实现植株再生。 5.远缘杂交：利用离体受精技术和组织培养结合可以实现远缘杂交，培育一些罕见的新物种。例如苹果与梨的杂交种。,19,植物组织培养技术,1.生物条件 外植体（Explant）主要指用于离体培养的植物或组织切段。 因素： 不同植物品种 同一品种不同取材部位、发育阶段。一般：生长点、幼嫩组织 大小适中，进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不易

8、成活,20,2.物理条件：,培养环境、组织培养室 无菌环境，人工控制温度、光照、湿度等培养条件。 需要一定的设备、器材和用具。,21,22,3 化学条件：培养基,（1）无机盐 培养基中无机盐的浓度通常在 25mmol/L左右。 根据添加量分为大量元素（浓度大于0.5mmol/L）和微量元素(浓度低于0.5mmol/L)。 大量元素主要有氮、硫、磷、钾、钙、镁。氮、硫、磷是蛋白质、氨基酸、核酸和酶的主要成分。 微量元素主要包括铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼等。这些微量元素对于蛋白或酶的生物活性十分重要，并参与生物过程的调节。,23,（2）有机物,常用的有机物成分包括糖类、氨基酸、维生素、醇类等。 糖

9、类：是离体培养的植物细胞所必需的，既可以作为碳源，又可以维持渗透压。蔗糖或D-葡萄糖是常用碳源。 蔗糖浓度多在310之间，因不同植物材料而异。 一般在诱导培养阶段蔗糖浓度高一些，分化培养时蔗糖浓度低一些。 大多数植物以蔗糖为碳源时生长都较好，少数适合在葡萄糖或果糖为碳源的培养基上生长。也有植物利用麦芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇和乳糖作为碳源。,24,氨基酸：通常采用蛋白质水解产物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。 维生素：直接参与酶的合成，还参与蛋白质和脂肪的代谢。尽管在培养过程中细胞能合成必需的维生素，但是数量上满足不了需求，需要在培养基中添加。 常用的维生素：硫胺素（Thiam

10、ine,VB1），吡哆醇（Pyridoxin,VB6）、烟酸（Nicotinic acid,Vpp）、生物素（Biotin,VH）、泛酸钙(Ca-pantothenate) 、叶酸(Folic acid)、维生素C等。 肌醇：在糖类的相互转化、维生素和激素利用等方面具有促进作用，并能刺激细胞快速生长。 腺嘌呤：是合成细胞分裂素的前体物质之一。添加腺嘌呤能促进细胞合成分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成。,（2）有机物,25,（3）调节物质,植物激素(Phytohormone)是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。能影响生长和分化。 在个体发育中，不论是种子发芽、营养

11、生长、繁殖器官形成以至整个成熟过程，主要由激素控制。 植物激素的作用机理：植物体内的激素与细胞内某种称为激素受体的蛋白质结合后，影响DNA、RNA和蛋白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表现出调节代谢的功能。,26,生长素（Auxin）,是由色氨酸通过一系列中间产物形成的。 在植物组织培养中，生长素主要用来刺激细胞分裂和诱导根的分化。常用的生长素有：吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。 生长素处理植物细胞主要作用于转录系统。用生长素处理植物细胞能够刺激mRNA和rRNA的

12、合成以及某些核蛋白的磷酸化。,27,细胞分裂素（Cytokinin）,大多是嘌呤族衍生物，自然状态下分裂素主要在根中形成，茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子也能合成分裂素。 分裂素的生理作用主要是诱导芽的分化促进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大。多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。 主要有激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6苄基腺嘌呤。 对于细胞分裂素的作用机理还不清楚。,28,激素配比,1956年，米勒（Miller）从鱼精子中分离得到比腺嘌呤活性高的激动素，效果比腺嘌呤好，代替了腺嘌呤而与生长素一起控制器官分化并

13、与斯库格（Skoog）一起提出了植物激素控制器官形成的观点,1948年，斯库格等较好地解决了如何从离体组织或器官中诱导植物再生的方法，并确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件：,29,兰花组织培养,兰花是第一个组织培养成功产业化的植物。 名贵兰花达摩兰：以禅宗“一花开五叶，结果自然成”的诗意命名。 在台湾，早期达摩量少，求种者多，非常昂贵；有人曾以一盆爪艺达摩交换台中市一栋高楼。 珍稀而名贵的达摩兰等名贵兰花，如今已成市井之花。一株不过百元。,30,激素配比举例,31,虽然海藻组织培养成果显著,但是仍然存在许多尚未解决的问题。海藻的愈伤组织由于诱导率低、生长缓慢及分化困难,很

14、难像高等植物一样大规模用于养殖育苗和次生代谢产物的生产。,海藻组织培养,32,其它一些有激素生理活性的物质，如：甾类、多胺类、水杨酸类等,五类植物激素,赤霉素：属于二萜类酸，由四环骨架衍生而得。赤霉素种类至少38种，广泛应用于农业生产。可刺激叶和芽的生长，提高产量。最突出的生理效应是促进茎的伸长和诱导长日植物在短日条件下抽薹开花。遗传上矮生的植物对赤霉素最敏感。,33,（4）常见培养基,MS培养基：1962年穆拉辛格和斯库格为烟草细胞培养而设计，其中硝酸盐的浓度高，适合植物原生质体、细胞和组织培养。 B5培养基：1968年甘伯尔格为大豆细胞培养而设计，铵的浓度低，适合木本植物的组织和细胞培养。

15、,34,培养基分类,富盐平衡培养基 是目前使用最广泛的一类，代表性的培养基有MS、LS、BL、BM、ER等。特点是：无机盐浓度高，微量元素种类齐全，浓度高；元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲能力、稳定性好、营养丰富，一般培养时无需再加入有机成分。 高硝态氮培养基 代表性培养基有B5、N6、SH。特点是：硝酸钾浓度高，氨态氮浓度低，含有较高浓度的硫胺素（VB1）。 中盐培养基 代表性培养基有Nitsch、Miller、Blaydes、H。大多是在MS培养基基础上进行改良设计。特点是：大量元素无机盐为MS的一半，微量元素种类减少、含量增高。维生素种类比MS增多，例如增加了生物素、叶酸等。

16、 低盐培养基 代表性培养基有 White、WS、HE、HB。特点是：无机盐、有机成分含量浓度低，多用作生根培养的培养基。,35,36,与微生物培养基的区别?,组分复杂，价钱昂贵 需要大量无机盐 多种维生素和激素 一般采用无机氮源 一般以蔗糖为碳源,37,4 植物组织培养再生植株的途径,两条途径完成： 一是器官发生途径：成熟细胞愈伤组织出根出芽完整植株。 二是体细胞胚发生途径：成熟细胞分生细胞胚状体完整植株。,38,（1）器官发生途径,植物的器官发生是指离体培养的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。 在自然界，许多植物的无性繁殖（如插条、嫁接等）属于器官发生途径的发育方式

17、。,39,过程：,（1）启动期：启动诱导外植体细胞脱分化和分裂。 用于培养的植物组织多是由已经分化成熟的细胞组成，这些细胞大部分已经丧失分裂能力。由这些细胞诱导产生愈伤组织必须首先使这些细胞恢复分裂能力，变成分生性细胞。 主要通过向培养基中添加一定浓度、种类和比例的外源激素刺激外植体细胞改变原来的代谢途径来诱导细胞活化，重新获得分裂能力，需要选择合适的较高浓度的生长素诱导剂（如NAA、IAA、2，4-D等）或细胞分裂素启动诱导外植体细胞脱分化和分裂。,40,（2）愈伤组织诱导：即细胞开始分裂并不断增生子细胞的过程。 这个阶段一般需要降低激素浓度，有些情况下甚至不需要生长素和分裂素。外植体外层细

18、胞开始分裂并脱分化。质量好的愈伤组织多呈淡黄（绿）色或无色、疏密适中。 （3）拟分生组织的形成：将愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下培养，细胞内部开始发生一系列形态和生理变化，分化出形态和功能不同的细胞。 此时，表层细胞分裂减慢，内部的局部细胞也开始分裂。在若干部位出现类似形成层的细胞群，通常称为“生长中心”，又可称为“拟分生组织”，该过程是器官发生的一个转变时期。,41,（4）器官原基和器官的形成：拟分生组织形成后，一些细胞分化成为管状细胞，进而形成维管组织，形成不同的器官原基，进一步分化出相应的组织和器官。 大多数情况下，植物再生过程中器官的发生是通过提供适宜的植物激素来实现的。,42,

19、植物愈伤组织培养的基本过程,愈伤组织的形成 愈伤组织的生长 愈伤组织的分化与形态的发生,此为概念流程图，图片非关联,43,44,（2） 体细胞胚发生途径,体细胞胚（Somatic embryo）又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。 体细胞胚发生途径是指体细胞在离体培养过程中经过了胚胎发育过程。体细胞胚起源于非合子细胞，因此不同于合子胚。 离体培养条件下体细胞胚的发生最早是在胡萝卜中发现的，经过胚状体形成、心形期、鱼雷期、子叶期、幼苗几个阶段 .,45,胡萝卜体细胞胚发生,A 器官外植体直接发生途径,B 悬浮培养细胞发生途径,C 愈伤组织发生途径,46,A 器官外植

20、体直接发生途径,属于离体培养条件下体细胞胚发生的直接途径。茎表皮、叶、子叶、下胚轴等外植体分化细胞经过脱分化后均可以产生胚状体。 以叶片为外植体直接形成体细胞胚为例，一般经过2个阶段：（1）诱导期。叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受刺激后进入分裂状态，形成小的瘤状突起；（2）胚胎发育期。瘤状物继续发育，经过球形胚、心形胚等阶段最后形成体细胞胚,47,B 悬浮培养细胞发生途径： 在悬浮培养的细胞中一些细胞可以产生胚性细胞团，一个胚性细胞团可以发育成一个胚状体，也可以产生多个胚状体。这种方式可以得到大量的胚状体。 C 愈伤组织发生途径：是胚状体发生常见的形式。愈伤组织内部或表面细胞均可以产生胚状体。这种

21、途径包括三个阶段：第一阶段，诱导外植体形成愈伤组织；第二阶段，诱导愈伤组织胚性化；第三阶段，体细胞胚形成。,48,5 植物组织培养的问题分析,（1）玻璃化问题：植物组织培养中，常会出现一些半透明状的畸形试管植物，这类植物体被称为“玻璃苗”，这种现象称为玻璃化（Vitrification）现象，又称过度水化现象。 由于玻璃苗的组织结构和生理功能异常，因此分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗，移栽大田更难成活，已成为组培的一大问题。 组织培养过程中试管苗的玻璃化现象主要是适应性的生理问题，是不能很好适应培养基和培养环境的结果。,49,（2）褐变问题 褐变（Browning）可分为酶促褐变和非酶

22、促褐变，主要是酶促褐变。酶促褐变是由多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)引起的。 当外值体处于机械损伤等逆境时，细胞膜的结构遭到破坏，酚酶催化多酚类化合物，使其发生氧化形成棕褐色的醌类物质和水；醌类物质经过非酶促聚合，形成黑褐色物质(羟醌与黑色素等)，引起褐变的发生。,50,（3）微生物污染 造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和内源菌。微生物污染主要由外植体带菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员操作不慎造成。外植体带菌引起的污染与外植体的种类、取材季节、部位、预处理及消毒方法等密切相关。 应该严格按照无菌操作，取材时应选择嫩梢、新芽或胚作为外植体材料，对外植体进行彻底消毒。

23、针对内源菌污染，有可以采取以下防治措施：（1）改进外植体消毒方法。结合常规的消毒方法，采用间隙消毒法。即经过一般的消毒过程后，把外植体放在不含激素和维生素的培养基中，培养一段时间后取出，再消毒1次；（2）反复检查培养物。在初代培养成功后要反复检查，不要急于扩大繁殖；（3）使用抗生素。,51,（4）品种限制,一些植物很容易通过组织培养进行无性繁殖：无心插柳柳成荫。目前被子植物组织培养成功的比较多。 裸子植物组织培养成功的比较少。很难脱分化诱导成具有全能性的细胞。,52,三、 人工种子（artificial seed）,体细胞胚再生途径的应用：,53,1、定义,人工种子（ Artificial s

24、eed）又称合成种子(Synthetic seed)或体细胞种子(Somatic seed)，是指将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳(Artificial endosperm)和人工种皮(Artificial seed coat)中形成的类似种子的颗粒。 结构上从外向里包括三部分，与天然种子具有类似的结构：（1）人工种皮外层，保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部力量冲击；（2）人工胚乳，含有必需的营养成分和某些植物激素；（3）胚状体或芽。,1978年在第四届国际植物组织培养大会上首次提出研制人工种子的设想,54,2 优点,便于运输和储藏。 人工胚乳可根据不同植物

25、的要求配制，通过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分，使人工种子优越于天然种子。 可以固定杂种优势，加速良种繁育。 可作为植物基因工程和遗传工程的载体。 可保存珍贵稀有植物品种。 利于快速繁殖，生产效率高。,55,3 关键技术问题,（1）胚状体同步发育 高质量和高数量的胚状体是大量制备人工种子的基础。控制胚状体发育的同步化是人工种子制备的核心之一，主要方法如下： 抑制剂法 在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂（如5-氨基尿嘧啶），一旦去除抑制剂后细胞可以同步发育。 低温法 低温处理抑制细胞分裂，再恢复正常温度可以使细胞分裂同步化。 渗透压法 不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定的渗透

26、压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。 通气法 细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯等）生成。可以通过在培养基中通入乙烯或氮气控制细胞同步分裂。 分离筛选法 用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开来，也可以采用密度梯度离心法来选择不同发育期的胚状体。,56,（2）人工种皮制作,理想的人工种皮(Artifical seed coat)应该具有保护胚状体的功能，并且具有无毒、良好的通气性、抗污染、适合运输等特点。 最早采用的材料是聚氧乙烯，但是具有一定毒性、易溶解于水等不足。 目前采用海藻酸盐较多，其具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性低、成本低廉等优点。但是也存在一些缺点，例如：

27、水性营养成分易流失、表面易结团等。因此，开发理想的人工种皮材料仍是一个重要课题。,57,（3）人工胚乳配制,胚乳是胚胎发育的营养保证。人工胚乳(Artifical endosperm)主要包括无机盐、碳水化合物、蛋白质等。 由于糖等物质的存在易导致微生物污染，所以还要加入防腐剂、抗菌素、农药等成分。 人工胚乳可以直接加在人工种子的凝胶囊中缓慢释放。,58,（4） 包埋技术,包埋是人工种子制作的重要一环。方法主要有以下两种： 干燥法 这是比较早的一种包埋方法。将胚状体置于23、70%左右相对湿度、黑暗条件下逐渐干燥，然后用聚氧乙烯等种皮材料包裹。 水凝胶法 这是目前比较常用的一种方法。用海藻酸钠

28、等水溶性凝胶与Ca2+进行离子交换后凝固的特点包埋单个胚状体或芽。种子硬度由凝胶浓度与络合时间控制。,59,海藻酸钠包埋,包埋液（人工胚乳）制备： 2%-3%的海藻酸钠+营养物、生长因子等 将成熟的健康的体细胞胚胎与包被液相混合，然后将其滴入适当浓度的氯化钙溶液中，经过胶复合作用的造形过程，在20-30分钟内形成内含细胞胚、有一定硬度的雏形人工种子。,视频： ,60,（5）贮藏与发芽,一般将人工种子贮藏在47低温、相对湿度小于67%的条件下。 随贮藏时间的延长,人工种子的萌发率会显著下降。,61,4 存在的问题,人工种皮性能不尽人意； 还没有一种符合多数植物胚状体需要的人工胚乳； 胚状体储藏阶

29、段的休眠控制； 如何保证长期储藏而又不影响萌发率； 制作流程较繁琐、成本高。 许多植物还不能成功地诱导出高质量体细胞胚。,62,人工种子应用举例,一品红又名圣诞花，是在元旦和圣诞节前夕观赏的一种著名盆栽花卉，属大朗科，常绿溜木。此花原产墨西哥及中美，现我国各地都有栽培。,63,1球形胚 2心形胚 3犁形胚 4子叶期胚 5人工种子 6人工种子萌发,64,本章小结,组织培养、人工种子。 要点： 1.植物组织培养的理论基础是什么？ 2.植物经组织培养的再生途径有哪两种？ 3.激素在细胞分化中是如何调节器官分化的？ 实践： 了解组培应用与市场新颖产品： 手指花卉、植物宠物,65,课后作业：,1. 自学：植物胚胎培养、植物脱毒技术