《凝胶层析分离技术》PPT课件.ppt

1、第十章 凝胶层析法,第一节凝胶的条件和类型 第二节基本原理 第三节 凝胶层析的实验技术 第四节 凝胶层析的应用,第一节 凝胶的条件和类型,层析凝胶必须具备下列条件： 凝胶层析中常用凝胶类型,层析凝胶必须具备下列条件,凝胶必须是化学惰性的 凝胶的化学性质必须是稳定的 凝胶上没有或只有极少量的离子基团 凝胶必须具有足够的机械强度,凝胶层析中常用凝胶,葡聚糖凝胶(dextran gel，Sephadex) 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，Bio-Gel P) 琼脂糖凝胶(agarose gel，Sepharose) 琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶(Superdex,葡聚糖凝胶部分

2、结构,葡 聚 糖 凝 胶 部 分 结 构,Sephadex,聚丙烯酰胺凝胶,聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 部 分 结 构,Bio-Gel P,琼脂糖凝胶(Sepharose,Sepharose,琼脂糖凝胶的部分结构,第二节 基 本 原 理,一、凝胶的结构与分子筛效应 二、凝胶床总体积 三、分配系数（Kd） 四、有效分配系数（Kav） 五、分子量与Ve 的关系,一、凝胶的结构与分子筛效应,动画演示,二、凝胶床总体积,Vt ：柱床 “总容积”， Vo：即存在于柱床内凝 胶颗粒外面空隙之间的 水相容积 Vi：即凝胶颗粒内部所 含水相的容积。 Vg：凝胶本身的容积,VtVo十Vi十Vg 或 Vt-V

3、o = Vi十Vg,三、分配系数（Kd,0Kd1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化,Ve：为实际测得的洗脱容积，自样品加入到组分最大浓度(峰)出现时所流出的容积,VeVo十KdVi,四、有效分配系数（Keff,将Vt-Vo代替Vi，则,即：VeVo十Keff(Vt-Vo,实际上， Keff是将以水作为固定相(Vi)改为水与凝胶颗粒(Vt-Vo)作为固定相，而洗脱剂(Ve-Vo)为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。 在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点,五、 Ve与相对分子量的关系,

4、Ve=K1-K2lgM K1、K2为常数，Ve可用如下表达式代替，Ve-Vo（分离体积）， Ve/Vo（相对保留体积），Ve/Vt（简化洗脱体积），Keff（相对洗脱体积） 在不同型号凝胶上蛋白质的选择曲线的差异,第三节 凝胶层析的操作技术,一、凝胶的选择与处理 二、凝胶装拄制备 三、样品上柱及洗脱 四、实验操作 五、凝胶柱的保养和凝胶的保存,一、凝胶的选择,排阻范围与粒度的选择 凝胶用量的计算,排阻范围的选择,粒度的选择,粒 度 的 选 择,凝胶用量的计算,干凝胶用量（g）：r2h/膨胀度 （膨胀度： 床体积/克干胶） 理论用量（1+10%）凝胶的处理,二、凝胶装拄制备,柱结构（、h）的选择

5、 装柱 柱鉴定,柱结构（、h）的选择,三、样品上柱及洗脱,加样量的控制 分析：1-2ml/100ml床体积 制备：10-30ml/100ml床体积 洗脱液的选择 控制凝胶收缩 影响洗脱的因素 流速对蛋白质分辨率的影响 操作压与流速的关系,流速对蛋白质分辨率的影响,黏度对分辨率的影响,黏 度 对 分 辨 率 的 影 响,凝胶柱层析操作压,操作压与流速的关系,加样量对分辨率的影响,I .加养量少时，A、B二种物质充全分开。 II.加养量适当时，A、B 二种物质刚刚分开。 III.加养量太大时，A、B二种物质只能部分分开,四、 凝胶层析的操作技术,凝胶的处理 柱层析系统的安装 凝胶装拄 样品上柱及洗

6、脱 Vo、Vi、Vt的测定 标准曲线的制作及Kd和Kav的计算 凝胶柱的保养和凝胶的保存,1、凝胶的处理,将称好的干粉倾人过量的洗脱液中，室温下充分溶胀。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴中加热溶胀3-5小时，这样还可以杀死细菌和霉菌，并排除凝胶内气泡。 为了保证流速稳定，获得较好的实验结果，使用前用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒，使凝胶颗粒大小一致,2、柱层析系统的组装,柱层析系统的安装,3、凝胶装柱,将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧； 向柱中加入约1/3体积的0.9NaCl溶液； 将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液； 凝胶

7、加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2nim。 连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。 （防止空气进入凝胶床,4、样品上柱及洗脱,加样量的控制 分析：1-2ml/100ml床体积， 制备：10-30ml/100ml床体积 洗脱液的选择：洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。 凝胶层析加样操作示意图 洗脱与自动收集记录 凝胶柱层析实物连接 凝胶层析中的分离行为,凝胶层析加样操作示意图,1、平衡好的层析柱。 2、沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起。 3-4、打开下口夹子，

8、使样品溶液流入柱内，同时收集流出液， 5-7、当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。 8-9、最后加入34mL洗脱液于凝胶上。 10、连接柱层析系统，自动收集记录,洗脱与自动收集记录,凝胶柱层析实物连接,凝胶层析中的分离行为蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾(黄色,5、Vo、Vi、Vt的测定,Vo的测定 选用分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000（或一种不被凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察)，测定它的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积（Veo）就是该柱的Vo值。 Vi的测定 选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积Vei，

9、减去Vo就是该柱的Vi 。常用铬酸钾(黄色)或有UV吸收的物质如N-乙酰酪氨酸乙酯来测定Vi。 Vt的测定,式中，为常数3.14，D为柱直径，h为凝胶床的高度,6、标准曲线的制作及Kd和Kav的计算,按操作技术4的方法，将1mL标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025molL氯化钾-0.2molL乙酸溶液洗脱。流速3mL10min，3mL管。用核酸蛋白质检测仪280nm处检测，用部分收集器收集，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计于280nm处测定每管光吸收值。 以管号(或洗脱体积)为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。 根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积(Ve) ，以蛋白质分子量的对

10、数1gMr，为纵坐标，Ve为横坐标，作出标准曲线。 根据已测出的Vo和Vi以及Vt，分别求出Kd和Kav,7、未知样品分子量的测定,完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积，重复测定1-2次，取其平均值。也可以计算出Kav分别由标准曲线查得样品的分子量,8、凝胶柱的保养和凝胶的保存,凝胶的保存可采用以下两种方法： （1）经常使用的凝胶以湿态保存为宜，加入适当的抑菌剂。常用的抑菌剂:0.02叠氮钠 (2)较长时期不使用的凝胶可采用干燥保存法。 依次用70、90和95乙醇逐步脱水，使凝胶皱缩，最后用乙醚洗涤干燥或在60-80下烘干,第五节 凝胶层析的应用,脱盐和浓缩 分离生命物质 测定分子量,思考题,凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么？分子量为8万和10万的蛋白质能否在Sephadex G-75柱中分开？为什么？ 概述哪些因子影响凝胶过滤的分辨率？为什么？ 在460cm和160cm；140cm