分子生物学大实验操作指南

1、分子生物学大实验操作指南单林娜 王莲哲 编常用试剂的配制方法（一）配方1、1MTris-HCl, pH8.0, 500ml 60.55g Tris + 400ml H2O + 约26 ml 浓HCl2、0.5 M Na2EDTA，pH8.0, 200ml （EDTA难溶于水，应优先配制，并加入适量NaOH助溶）37.22g EDTA + 180ml H2O + 约8 g NaOH片（若是EDTA二钠盐可减半）3、10% 葡萄糖 10g 葡萄糖 + 90ml H2O4、1M NaOH：4g NaOH+ 96 ml H2O5、KAc (3M K. 5M Ac) （9.8143）g KAc + 30

2、ml H2O + 11.5ml 60.52/1.049 冰醋酸 + 28.5ml H2O定容至100ml（溶液III: KAc 14.7g,HAC 5.8mL, 加水至50mL。乙酸；醋酸；冰醋酸 【英文名称】acetic acid 【结构或分子式】 CH3COOH 【相对分子量或原子量】60.05 【密度】1.049 醋酸钾(医药级) C2H3KO2 F.W. 98.14）6、70% 乙醇7、TE50ml ：10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0，1 mmol/L EDTA，pH8.0 1MTris-HCl（pH8.0 ） 0.5ml 0.5 M Na2EDTA（pH8.0 ）

3、0.1ml H2O 49.4ml8、CTAB抽提液100ml：2%CTAB（十六烷基三乙基溴化铵） 100mmol/L Tris-HCl, pH8.0 / 1MTris-HCl（pH8.0 ） 10ml20 mmol/L EDTA，pH8.0 / 0.5 M Na2EDTA（pH8.0 ） 4ml1.4mol/L NaCl (8.18g) （二）操作步骤1、刷洗试剂瓶等玻璃器皿 清水去污粉清水4遍蒸馏水2遍2、按配方配制试剂 计算用量写出配方称量（学习掌握电子天平用法）混溶3、灭菌（复习巩固压力锅用法）实验一 总DNA提取（4学时）（一）总DNA提取1目的：学会提取纯化DNA的试剂的配法，学会

4、使用离心机、移液器，掌握总DNA 的提取和纯化技术。2实验原理：在SDS或 CTAB物质存在时，经机械研磨，使细胞破裂并释放出内含物，提取DNA。 CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活DNase。 3实验器材和试剂 试材：刺蛾蛹仪器、用

5、具：离心机、离心管、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩等。 4实验准备：需配置的药品和缓冲液：提取DNA缓冲液（CTAB法）: 2% CTAB(W/V),100 mmol/L Tris-HCI pH 8.0, 20 mmol/L EDTA pH 8.0, 1.4 molL-1 NaCl，2% PVP (灭菌后加入2% PVP ，使之充分溶解）。在研磨叶片前加入1%（V/V）-巯基乙醇。 TE(pH 8.0): 称取1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2 ，先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH 8.

6、0，再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min。 氯仿/异戊醇（24:1,v/v）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4保存。 酚 : 氯仿 : 异戊醇(25:24:1)：按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4保存。 5操作步骤：（1）将单头蛹放入1.5ml 离心管中，加入足量液氮充分研磨；（2）吸取500l 65预热的2CATB缓冲液0.1M Tris-HCl(PH 8)，1.4MNaCl，0.02MEDTA，2%CTAB,0.2%-巯基乙醇，注入管中少许，继续研磨后，将余液全部注入；（3）匀浆物置于65孵育4560min，中途混匀

7、数次；（4）短暂离心，将上清液转至一只新管，沉淀用200l 2CATB再悬浮，孵育2030min后离心；（5）将两次的上清液合并，用等体积的苯酚/氯仿（1/1）抽提，12000rpm离心10min; （6）水相用等体积的氯仿再抽提一次，12000rpm离心10min; （7）水相与2/3体积异丙醇混合，4放置1小时至过夜；（8）10000rpm离心15min使DNA沉淀；（9）用70%乙醇漂洗，干燥，加0.1TE 40l再悬浮。（10）20保存。（二）总DNA提取产物电泳鉴定1目的：学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。2原理：DNA分子在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的

8、阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3试剂：（1）电泳缓冲液：TAE：Tris-醋酸缓冲液 或TBE：Tris-硼酸缓冲液（2）上样缓冲液：一般为6浓缩液（3）溴乙锭（10mg/ml）（4）1.5%2%琼脂糖总DNA提取物，DNA分子量标准。4实验准备 配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L），6加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。5操作步骤（1）称取0.4g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50

9、ml TAE电泳缓冲液(1)，放入微波炉中烧开（1min）。注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。（2）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60C）。（3）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。（4）在水平电泳槽中加满1TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。（5）待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出

10、梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。（6）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10ml的吸液头取管中DNA 59l，加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3ml DNA分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。（7）打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极

11、）。电泳将进行约30min。（8）当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。放入凝胶成像系统中拍照。实验二 PCR扩增制备目的基因（4学时）（三）PCR扩增制备目的基因1目的：掌握聚合酶链式反应的基本原理和实验技术方法。2原理： 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction， PCR)的原理类似于 DNA的天然复制过程。待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。（1）变性：加热使模板DNA在高温下(94)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。（2）退火：使溶液温度降至5060，

12、模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。（3）延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按53方向复制出互补 DNA，即引物的延伸阶段。 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后 DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。3仪器、材料与试剂仪器：（1）PCR

13、热循环仪（2）琼脂糖凝胶电泳系统试剂：（1）引物：根据待扩增DNA不同，所用引物也不同。选择引物时要符合一般引物设计的原则，必要时要用微机进行结构分析。采用通用引物TY-J-1460（5-TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC-3）和C2-N-3661（5-CCACAAATTTCAG- AACATTGTCCA-3）（Simon et al，1994），进行刺蛾蛹的CO、CO及tRNA基因扩增。（2）耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌分离出来，能耐受93100C的高温而不失活。（3）10PCR缓冲液：250500 mmol/L KCl100500 mmol/L Tris-HCl p

14、H8.41520 mmol/L MgCl2 0.5% Tween-201 mg/L BSA(fiction V)无核酸酶（4）dNTPs储存液：i. 有商品化的中性混合液(2 mmol/L,10) 供应，如需自己配制，则将dATP、dCTP、dGTP、dTTP钠盐各10 mg溶入2ml去离子水（浓度为5 mmol/L） ，用0.1mol NaOH调至pH7.07.5，分装，-20C保存。（5）样品处理试剂：不同样本所需试剂不同，根据具体情况而定。4实验准备TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头

15、盒（灭菌）。5操作步骤在0.2ml PCR 微量离心管中配制25l反应体系。PCR反应体系为：10ExTaq缓冲液 2.5l2.5mM dNTPs1. 1.5l25mM magnesium 2.0l，20M上游引物 0.3l20M下游引物 0.3l5Ul-1ExTaq DNA 聚合酶 0.2l510ng l-1总DNA模板 1.5l纯水 16.7l,总体积 25.0lPCR反应条件是： 1) 95 5min预变性，2) 94 40sec，3) 52 50sec，4) 72 2min，5) 重复2） 4），共35个循环，6) 72延伸10min；7) 4保持。PCR产物电泳鉴定同（二）。取PCR

16、反应产物59l，在1%琼脂糖凝胶上，5V/cm电压电泳50min。紫外灯下观察结果。实验三 目的基因纯化及其与载体的连接（4学时）（四）扩增目的基因片段的回收与纯化在紫外透射仪下迅速切取含有目的基因片段的凝胶条,将其装入1.5mL的离心管中, 按北京天为时代公司的琼脂糖凝胶DNA回收Kit 说明书进行。操作流程：（1）用干净刀片切下含DNA的琼脂凝胶块，称其重量,加3倍体积溶胶液;(约500l)（2）65水浴10min，直至胶块完全溶解，降至室温;最好在冰上放一会。（3）将溶液加入离心吸附柱中冰浴2min，12000rpm离心30 sec, 弃掉废液;（4）加700 L漂洗液，12000rpm

17、离心30 sec, 弃掉废液;（5）加500 L漂洗液，12000rpm离心2min, 弃掉废液,取出吸附柱，放入一干净离心管中，加适量(50l)洗脱缓冲液溶解(EB先在6570水浴中预热)室温放置2分钟, 12000rpm离心1分钟。置-20保存备用。注：PCR产物可以直接与T载体连接，然后转化感受态细胞。（五）CO和CO目的基因片段与克隆载体质粒的连接1目的：学会DNA片断的体外连接技术。2原理：在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。 3操作步骤按pMD18-T Vector 提供的方法，将PCR扩增产物CO、C

18、O及tRNA基因与pMD18-T(大连宝生物公司)载体连接。连接反应总体积为10L，体系组成如下： 回收纯化的PCR扩增目的基因片段 4.0 l 10Ligation solution 5.0 l pMD18-T载体（10ng/ l） 1.0 l共 10.0 l 混匀后，416连接18-24小时。实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（8学时）（六）感受态菌的制备1目的：学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。2原理：细菌在0C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。3试剂E. coli DH5，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd W

19、ater。4实验准备1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），无菌dd Water，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。5操作步骤 （1）取一支无菌的三角烧瓶，在超净工作台中加入20ml LB（不含抗菌素！）培养基。（2）从超低温冰柜中取出DH5菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入培养基中，37摇床培养过夜。（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中，37下250r/min摇床培养至对数生长早中期约为11.5h，测定OD5

20、90为0.375（0.40.6，细胞数108/ml，此为关键参数！）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。（4）将菌液分装到1.5ml预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置1015min，然后于4，4500rpm离心10min。（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入750l冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即混匀，插入冰中放置20min。（6）4，4500rpm离心10min，弃上清液后，用200l 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。可以直接用作转化实验，或立即放入-80超低温冰柜中保藏（可存放数月）。（七）细菌转化1目的：学会质粒DNA转化感受态

21、受体菌的技术。2原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。3试剂LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG，X-gal。4实验准备无菌dd water，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。6操作步骤（1）事先将恒温水浴的温度调到42。（2）取出一管（200L）感受态菌，插入冰上，冰浴5min。（3）加入510L连

22、接好的质粒混合液，轻轻震荡后放置冰上60min，每10min震荡1次。（4）轻轻摇匀后插入42水浴中90sec进行热休克，然后迅速放回冰中，静置10min。（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入800l LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37震荡1-2h。（6）蓝白斑筛选：用含0.1%Ap的LB培养基（即LB中加入1%的0.1%Ap稀释液）倒选择平板，每块约需20ml LB，凝固后在平板上滴加40L 2% X-gal，4L 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。（7）在超净工作台中取上述转化混合液100200L，分别滴加到3块选择平板上，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。（8）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37恒温培养箱过夜或1216h。（9）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑为转化菌落。（八）转化克隆的筛选和鉴定1目的：学会用酶切法或PCR法筛