基因工程32章

1、第,四,节,DNA,限制酶切反应和,限制酶谱绘制,一,DNA,的限制酶反应,1,酶单位定义,使,1g,某种,DNA,在最适反应条件下和,1,小时内,完全酶切所需的限制酶活性,2,酶切反应类型,1,完全酶切,SV40(5243bp) pBR322(4363bp,2,部分酶切,3,酶切反应最适条件,1) DNA,分子的组成,i,碱基组成与排列方式,ii,识别位点两侧的碱基组成与排列方式，同一,DNA,分子中,不同识别位点的酶切速度可相差,10,倍（如,中的,Eco,RI,位点,2,反应条件,i,DNA,溶液的纯度和浓度（反应浓度,依实验目的而定,Hpa,I,C CGG,1 26,Tha,I,CG

2、CG,0 23,ii,限制酶的纯度和稳定性,i,纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件,ii,稳定性：保存和反应,iii,反应缓冲液,常用三种核心缓冲液，即高,H,，中,M,低,L,盐缓冲液，不同温度下的,pH,值,iv,反应温度,大多数为,37,v,双酶切和多酶切反应,同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用的缓冲液和反,应温度必须相同，即使相同时，一旦发生部分酶切反应,便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者,分别酶切,i,第一种酶切,电泳检查,酚,氯仿纯化,第二种酶切,可不考虑酶切先后顺序，但操作步骤多,ii,采用低浓度盐缓冲液的限制酶切,电泳检查,采用高,浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单，

3、但要分先后,假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考虑,的则是相互间的酶切是否有影响，两种酶切顺序不同时,其结果大不相同,如,Sma,I,Bam,H(c,Bam,HI,Sma,I(p,二、限制酶图谱的绘制,1,完全酶切作图法,1,单酶切作图法,一长度为,5Kb,的线状,DNA,分子用两种限制酶完全酶切的凝胶,电泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用下述,辅助方法之一,i,单酶部分酶切,部分酶切时，各种可能性均存在，但只,有相邻的两个,DNA,片段才有可能出现在凝胶上,ii,末端标记完全酶切,DNA,片段,末端标记,完全酶切,凝胶电泳,EtBr,染,色观察,放射自显影,2,双酶

4、切作图法,单酶切结果只能确定一种酶的位点，要将两种单酶切结果画,在一张图上时则不行,分别作图时，同一种酶的两种作图法都是对的，但当作在一张,图上时，上述两种可能性中只有一种是对的，因此必须进行双,酶切反应，其结果见图,根据上述的原理和步骤，前述的,5 Kb,片段酶,I,与酶,II,的定位,结果可用两种方法之一,i,单酶切,分离,DNA,片段,第二种酶切,凝胶电泳,ii,单酶切,第二种酶切,凝胶电泳,如果要同时将两种限制酶定位在一条,DNA,上时，单酶完全酶切,作图就没必要了,2,末端标记,部分酶切作图法,Smith-Brinstiel,法,DNA,片段,末端标记,酶,1,切,分离带标记,DNA

5、,片段,酶,2,部分酶,切,电泳,EtBr,染色,照相,放射自显影,结果,单端标记方法,人工合成单端标记法,限制酶切单端标记法,单端标记方法,1,人工合成单端标记法,单端标记方法,2,限制酶切单端标记法,3,末端标记双相作图法,方法,2,仍存在两个不足之处,酶,1,的选择不能靠近,DNA,中央；需先分离,DNA,片段,该法可克服上述缺点,现假设有一片段长,10 Kb,其中,RE1,有三个切点,RE2,有一个切点，其图谱可能是,4. Bal31,顺序酶解作图法,DNA,片段,Bal31,处理不同时间取样终止反应,限制酶切,凝胶电泳,染色观察结果,5,切口移位作图法,可检测出,100bp,片段,双

6、链,DNA,切口移位,限制酶切,电泳,放射自显影,6,大尺度限制酶作图,1,条件,i,电泳方法,脉冲场凝胶电泳,ii,样品制备,原位,DNA,制备和酶解,iii,人工染色体构建,pYAC,载体构建,iv,脊椎动物基因组中的,CpG,和植物基因组中的,CpXpG,序,列存在,2,一般作图程序,原位,DNA,样品制备,原位,DNA,限制酶切,脉冲场凝,胶电泳,染色,观察,3,大尺度作图用酶,i,稀有识别序列内切酶,I,型内含子内切酶,真菌细胞核,和线粒体基因组,T4,噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体,酵母,HO,内切酶；大肠杆菌,recA,虽然这些内切酶识别的序列都很长,10-19 bp,但高,等动植物

7、基因组中含有这类位点却极少，因而很少使用,ii,II,型限制酶,人基因组有,45,000,个,CpG,岛,一个长度约为,1.5 kb,富含,GC,的,DNA,片段,其中只有,25,的,CpG,岛未被甲基化,这些,CpG,岛常位于基,因的,5,端,未被甲基化的,CpG,岛平均长约,270 kb,可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别,8,或,6,bp,序列；富含或只含,GC,序列；含有,CpG,序列,i,Asc,I-GG,CGCG,CC,和,Not,I-G,CG,GC,CG,C,ii,Fse,I-GGC,CG,GCC,和,SrF,I-GCC,CG,GGC,iii,Sfi,I-GGC,C

8、N,NNNNGGCC,iv,Cpo,I,Csp,I,Rsr,II,CG,GA(T)C,CG,v,Bss,HI-G,CGCG,C,Eag,I,CG,GC,CG,和,Sac,II-C,CGCG,G,vi,Nae,I-GC,CG,GC,Nar,I-GG,CG,GC,Sma,I-CC,CG,GG,vii,Mlu,I-A,CGCG,T,Nru,I-T,CGCG,A,Pvu,I,CG,AT,CG,Spl,I,CG,TA,CG,CH,3,CH,3,CH,3,CH,3,CH,3,CH,3,三,限制酶图谱的用途,1,基因工程中的应用,1,克隆载体图谱,便于,DNA,重组,2,克隆片段图谱可用于次克隆,体外突变,

9、基因定位,核酸定,序,2,突变体检测,遗传学图谱必须依赖各种突变体存在,因此必然发生了,基因型和,表型的变化,限制酶图谱,不必依赖表型变化,酶谱的变化一定是基因型发生了,变化,但不一定发生了表型变化,即,表型的变化不一定会导致酶谱,变化,1,缺失突变体的检测,某,DNA,片段消失,代之以一较小,DNA,片段,2,插入突变体的检测,某,DNA,片段消失,代之以一较大,DNA,片段,缺失和插入突变体的检测,I,I II,点突变的检测,II,3,点突变的检测,某,DNA,片段消失,代之以两较小的,DNA,片段,前者的长度等于后两者长度之和,位点增加,某两,DNA,片段消,失,代之以一较大,DNA,片

10、段，前者的长度之和等于后者长度,位,点消失,3,重组频率的测定,同一染色体座位上的等位基因可能具有不同的表型,从而构成遗,传多型性,等位基因的限制酶谱也可能具有多型性,这就是限制,酶片段长度多型性,Restriction,fragment,length,polymorphism,RFLP,不同个体,总,DNA,限制酶完全酶切,Southern,印迹,杂交,结果分析,当不同个体交配时,除自由组合外,也可发生重组,如不同,果蝇交配时,其后代的表型和限制酶谱可为,表型,红,白,1:1,限制酶谱,30,个体已发生了重组,4,遗传疾病的诊断,分析正常人与遗传病患者的某些,DNA,片段的限制酶谱,便可发,

11、现其差异,并总结出各种遗传疾病的限制酶长度多态性图。临床,诊断时，将遗传病可疑患者的限制酶谱与之比较,便可判断其是,否患有此病,第五节,DNA,的,连,接,一,DNA,的连接方法,两种不同的,DNA,分子可以经过下述的方法之一进行连接,而,方法的选用则是根据其两者末端的,DNA,结构,1,直接连结法,该法适用于,1,同种限制酶作用不同,DNA,片段产生的,相同粘性末端,重组,DNA,可用同种酶再切开,但识别简并序列的限制酶除外,如,Ara,I,2,不同种限制酶作用不同,DNA,片段产生的,相容性末端,i,重组,DNA,分子不能再为这两种酶所作用,如,Bam,HI,Bgl,II,ii,重组,DN

12、A,分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用,的可能性较小,如,Mbo,I,Bam,HI,3) PCR,产物与特定载体的连接,4,限制酶和其他方式产生的,平整末端,2,人工接头连接法,1,人工接头,linker,的结构,i,中轴对称互补,可自行退火形成双链,如,5-CCG,GAATTC,CGG,3,3-GGC,CTTAAG,GCC-5,ii,至少有一特定的限制酶识别位点,iii,某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持,同相,如,八聚体,d(G,GAATTC,C,十聚体,d(CG,GAATTC,CG,十二聚体,d(CCG,GAATTC,CGG,2,用途,i,平整末端的连接,各种结构

13、的,DNA,末端均可经过修饰变成,平整末端,2 X 5-CCG,GAATTC,CGG-3,退火,ii,产生新的克隆位点,iii,合成匹配接头,3,连接方法,人工接头磷酸化,退火形成双链,与目的,DNA,相连,限制,酶切,两,DNA,分子相连,4,适用范围,人工接头连接法适合于那些只有一种,DNA,片段需加人工接头,就可以与另一,DNA,分子相连的,DNA,分子,利用人工接头也可使任意,两个平端的,DNA,分子相连,这种直接相连的办法简便,快速,但最后,连接起来的,DNA,可能具有不同的结构,为避免这些结构的产生,可,先使一种,DNA,先加上人工接头后,再与另一种,DNA,分子相连,3,匹配接头

14、连接法,人工接头虽然可连接两个具不同末端的,DNA,分子,但这些末端在,加入人工接头前必须变为平整末端,然而,有时实验不容许使用人,工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于,直接连接各种具不同末端的,DNA,分子,i,平端,突起末端,5,突起,3,突起,ii,粘性末端,5,突起,5,突起,Eco,RI,Hin,dIII,5,突起,3,突起,Eco,RI,Pst,I,3,突起,3,突起,Pst,I,Sac,I,1,匹配接头的结构特点,i,由两个低聚核苷酸组成,ii,部分区域可以互补,iii,退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端,2,匹配接头的种类,i,预制匹配接头,连

15、接平端和粘性末端,人工接头,匹配接头,预制匹配接头,ii,转换匹配接头,连接,5,突起和,3,突起末端,二匹配接头退火,转换匹配接头,二人工接头,连接酶,双酶切,转换匹配接头,iii,单链匹配接头,连接,5,突起和,3,突起末端,4,同聚物加尾连接法,在两个不同的,DNA,分子末端各加上一个可互补的同聚物,即,AT,或,GC,5,连接方法的选择,方法选择的依据,1,两,DNA,分子的末端结构,2) DNA,分子的限制酶谱,3,是否需要回收,DNA,片段,连接方式的选择,载体末端,外源,DNA,末端,常规连接,脱磷酸化,同聚物,平端连接,补齐,人工接头,结构,结构,载体,加尾,外切酶,5,突起,

16、相容,5,突起,第二选择,第一选择,不能,不能,不能,5,突起,非相容,5,突起,不能,结合使用接头,不能,不能,第一选择,3,突起,相容,3,突起,唯一选择,不能,不能,不能,不能,3,突起,非相容,3,突起,不能,不能,第一选择,不能,第二选择,或平端,3,突起,5,端突起,不能,不能,第一选择,不能,第二选择,补齐后,平端,平端,不能,可能,可能,第一选择,可能,平端,3,或,5,突起,不能,不能,第一选择,不能,第二选择,二,DNA,的连接反应,1,连接反应理论,当两种,DNA,分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结,果与以下因素有关,1,连接反应系统中的总,DNA,浓度,i,2,

17、一个,DNA,分子靠近同一分子另一端的有效浓度,j,该值与,DNA,的长度成反比,即,DNA,分子越大,该分子的两末端越不,易相互作用,即自身环化,3,两种不同,DNA,分子的克分子浓度之比值,2,连接反应条件,1,评估连接反应结果的方法,i,琼脂糖凝胶电泳,ii,大肠杆菌转化,2,反应条件,i,温度,ii. ATP,浓度,iii,时间,iv,连接酶浓度,v,克分子比率,第六节,PCR,技,术,一,DNA,体外扩增技术,1,PCR,反应体系,1,基本原理,PCR,Polymerase Chain Reaction,聚合酶,链式反应,一个,DNA,经,n,次扩增后,一个,DNA,分子可变为,2,

18、n,个分子,DNA,扩增需要对待扩增的,DNA,序列有所了解，至少要对,其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物,2,基本操作,待扩增的,DNA,片段,dNTP+Tris,HCl,缓冲液,两引物,90,变性,30 50,退火,30,加入,Taq DNA,聚合酶,75,1,进入第二次循环,25-30,次循环,90变性解链,与引物退火，50,引物及延伸，75,n次扩增,第,一,次,循,环,第,二,次,循,环,3,5,3,5,3,5,5,3,5,3,3,5,5,3,3,5,3,3,5,3,3,5,5,5,3,5,5,3,90变性解链,与引物退火，50,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3

19、,5,5,3,3,5,引物及延伸，75,3,3,5,3,3,5,5,5,3,3,5,3,3,5,5,5,PCR,原,理,示,意,图,2. PCR,产物的鉴定,1) PCR,产物的大小和限制酶谱分析,bp,bp,500,100,600,500,100,RE,2,寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析,OR,分析,Oligomer Restriction analysis,OR,分析对于,PCR,产物的限制酶位点上发生了点突变的检,测极其有用,GACTCCTG,G,CTGAGGAC,C,A,T,3,3,GACTCCTG,G,CTGAGGAC,C,T,A,5,3,3,5,5,5,beta A beta S,

20、GACTCCTG,G,A,T,CTGAGGAC,C,3,3,5,5,GACTCCTG,G,A,A,CTGAGGAC,C,3,3,5,5,CTGAGGAC,C,T,3,3,5,5,GACTCC,TG,G,A,GACTCCTG,G,A,A,CTGAGGAC,C,3,3,5,5,GGAC,C,ACTCCTG,G,A,A,3,3,5,5,G,CTGAGGAC,C,T,3,3,5,5,GACTCC,TG,G,A,HinfI,DdeI,变性/与标记寡,核苷酸探针复性,8,n,t,3,n,t,PCR,产物的,OR,鉴定,3,分子杂交,适合于检测,PCR,产物的非限制酶位点上碱基突变。它是利,用两条引物链间的

21、特异性,DNA,片段作探针,常为人工合成的一段,低聚核苷酸，约,20 n.t.,当这种探针的核苷酸序列与待测的,DNA,核苷酸序列完全互补时才能杂交。如果利用多种等位基因特异,性寡核苷酸探针,allele-specific Oligonucleotide, ASO,与,PCR,产物进行杂交，可检测出,PCR,产物的碱基突变,可直接利用斑点杂交方法用于基因型分析,110bp,珠蛋白,PC03,19A,19S,19C,PC04,19A,19S,19C,AA,AS,SS,SC,CC,AC,XX,AA,AS,SS,SC,CC,AC,XX,PC03:ACACAACTGTGTTCACTAGC,PC04:C

22、AACTTCATCCACGTTCACC,19C,A,CTCCT,AGGAGAAGTCTGC,19S,T,CTCCTG,GGAGAAGTCTGC,19A,CTCCTGAGGAGAAGTCTGC,4,核苷酸序列分析,DNA,扩增产物,变性,与末端标记的扩增引物或定序,引物退火,双脱氧核苷酸链终止反应，测定,DNA,序列,5,5,3,3,5,3,5,3,5,3,5,变性,与引物退火,dNTP,ddNTP,Klenow frag,A C G T,PCR扩增产物,二,Taq DNA,聚合酶的特点,Taq DNA,聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌,YT-1,中分,离纯化而得。该酶的分子量为,63-68 k

23、D,1,无磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性，无内,切酶活性，但具有依赖于聚合酶活性的,5 3,外切酶活性,2,最适反应温度为,80,3,最适,pH8.0,和最佳反缓冲液,Tris,HCl,4,最佳二价阳离子,Mg,2,10 mM,5,具良好的热稳定性：在,90,下连续反应,30,分钟仍有,70,的酶活,50,100,150,温度,掺,入,的,H,d,N,T,T,P,微,克,分,子,数,3,相,对,酶,活,的,分,率,20,40,60,80,100,0,10,20,30,40,50,60,95,90,70,反应时间（分,掺,入,的,H,d,N,T,T,P,微,克,分,子,数,3,20,4

24、0,60,80,25,50,75,Mg,二价阳离子浓度（mM,Mn,掺,入,的,H,d,N,T,T,P,微,克,分,子,数,3,100,200,6,7,8,9,10,pH,1,2,3,1. 25 mM磷酸缓冲液,2. 25 mMTris-HCl缓冲液,3. 25 mM甘氨酸缓冲液,Taq DNA,聚合酶的特性,当采用,Taq DNA,聚合酶进行,DNA,体外扩增时，必须考虑到以下五个参数,1,热稳定性,在,PCR,循环中,DNA,的变性时间常为,30,60,若循环,30,次，其累,计加热变性时间为,15,30,Taq DNA,聚合酶在,90,下保温,30,仍具有,70,酶,活性，可大大减少操作

25、步骤,易于实现自动化,2,模板与引物的特异性,当,退火温度和,DNA,链延伸,时温度,偏低,时，引物与,模板配对的,特异性大大降低,从而导致一些不需要的,DNA,片段被扩增,显然，其产物的专一性大大降低，使结果无法分析。由于,Taq DNA,聚合酶,最适反应温度为,80,退火温度可提高到,55,以上,由此大大减少了引物,与模板的非专一性结合，使,产物均一性大大增加,3,合成产率,反应底物和产物在,DNA,扩增中不断发生变化，最终将会导致,聚合反应进入,平台期,平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明,利用,Klenow,片段进行,20,次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为,2,10,5,当

26、采用,Taq DNA,聚合酶时，扩增,25,次后才进入平台期，拷贝数可大,4,10,6,4,延伸长度,有时为了获取较长,DNA,片段的扩增，这就要求,DNA,聚合酶,具有较强的延伸能力。当扩增片段大于,250 bp,时,Klenow,片段和,T4,聚合,酶扩增产率大大降低。利用,T7 DNA,聚合酶,可使扩增片段达,2 Kb,当利,用,Taq DNA,聚合酶,时，最长延伸长度为,4.4 Kb,经改造的,Taq DNA,聚合酶可扩增出,40 kb,的,DNA,片段,5,扩增产物的可靠性,评估,DNA,聚合酶的一个重要指标是它复制,DNA,的可,靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于,PCR,技术的可

27、靠性是至关重要的,Klenow,片段的错误掺入率为,10,4,Taq DNA,聚合酶的错误掺入率为,5,10,3,而,T4,聚合酶的错误掺入率为,10,7,注,1,退火温度常与引物的长度和碱基组成有直接相关关系,引物越长或,GC,含量较高，退火的温度可以高些,反之则低,些。退火温度越高，引物,与模板（即扩增的,DNA,结合的特异性越高，这可大大减少非特异性,DNA,片段的扩增,引物的长度常为,20-28,聚体，其中有,50,以上的,GC,含量，无自身互补,序列，特别是,3,末端不应有内部二级结构，引物加量为每,100l l20pmol,2,出现平台期的原因可能有,后期循环酶浓度或聚合时间不足,

28、引物耗尽,dNTP,耗尽；产物浓度过高，以致,ds-DNA,解链后又迅速,退火，不能与引物结合,3,链延伸长度与延伸时间有关,对于,Taq DNA,聚合酶，每分钟可形,成,2000 n.t,或更多。如果要扩增,3-4 Kb,的,DNA,在,72,下需将酶延伸时间,增至,3-4,分钟,三,PCR,方法,1,强化,PCR,Boosted PCR,将,PCR,分为两个阶段,1,引物与模板之比为,10,7,扩增,20,个周期,2,引物与模板之比为,10,12,10,13,再扩增,10,个周期,该法适合于待扩增,DNA,浓度较低时,2,混合寡核苷酸引物,PCR,mixed oligonucleotide

29、,primed amplification of cDNA,MOPAC,根据各氨基酸最常用的密码子合成一系列引物，对某一,特定,cDNA,进行扩增,3,锚定,PCR(Anchored PCR,A-PCR,5,3,3,PCR,TdT,dGTP,5,3 5,5,3,G.G,3,5,5,C.C,3,G.G,3,5,5,C.C,3,G.G,3,5,4,连结,PCR(ligation mediated PCR,该法可用于核苷酸序列测定,DNA,足迹分析技术和测定甲,基化作用,DNaseI,变性、引物,链延伸,加接头（引物,外侧引物,内侧引物,连接引物,标记引物,5,不对称,PCR(Asymmetrica

30、l PCR,采用不同引物浓度比率，如,50,1,100,1,可得大量拷贝的,ssDNA,用于测序,6. GC,串,PCR (GC clamp PCR,应用,变性剂梯度凝胶电泳,denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE,可检测出,DNA,片段中一对碱基的变化，在,DNA,分子一端,加上一,GC,串（约,40 n.t,利用它的高解链温度特性，在梯度变性,胶上可检测出原,DNA,链中最高解链区内的点突变,5,GC,20nt,1,2,3,4,1. 野生型,2-4.突变型,7,竞争引物,PCR,competitive oligonucieotide pri

31、mer,PCR,COP-PCR,有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争,DNA,模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于,测定某一,DNA,片段上是否带有某一已知碱基置换,准确配对引物,错配引物,共同引物,PCR,or,or,模板,模板,or,模板,PCR,等位基因,无突变,模板,等位基因,有突变,无PCR产物,8,等位基因专一,PCR(Allele specific PCR,ASPCR,该法可用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症,9,反转,PCR(inverserar inverted PCR,该法可用于扩增已知,序列两侧的未知序列,R2,X,Ligase,Y,R1,

32、Y,X,Z,R2,R1,P1,Z,R2,P2,10,反向,PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR,主要用于,mRNA,的,PCR,扩增,mRNA,引物1,5,RT,5,3,AAA.A,3,TTT.T,5,3,AAA.A,RNaseH,5,3,TTT.T,5,3,AAA.A,5,3,TTT.T,5,3,AAA.A,5,3,TTT.T,5,3,5,3,5,3,RT,5,3,TTT.T,TdT + dGTP,GG.G,CC.C,限制酶,识别序列,限制酶,识别序列,11,加端,PCR(Add-on PCR,在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列，如某种限制,酶的识

33、别序列，某一基因的调控或其它必需序列,12,错配,PCR,mismatched PCR,利用该法可在一已知,DNA,序列中引起点突变，缺失突变和插,入突变,P1,P3,P2,靶顺序,P4,分别扩增,5,3,3,5,5,3,3,5,除去引物,变性/复性,P1,P4,产生点突变DNA,PCR,延伸,3,5,5,3,13,重组,PCR(Recombinant PCR,利用该法可将不同基因的,DNA,片段连接在一起,与基因2启动子同源,基因1,编码区,PCR,5,3,变性/复性,启动子,与基因1编码区同源,PCR,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,链延伸,基因2,3,5,5,3,14,基

34、因克隆,PCR,利用该法可获一完整的,cDNA,克隆,SP6,T7,PCRI,PCRII,PCRIII,四,定量,PCR,技术,1,基本原理,N=N,0,1+eff,n,N,最终拷贝数,N,0,起始拷贝数,eff,扩增效率,n,扩增次数,2,测定方法,竞争,PCR,法,加入已知量的标准物,RT-PCR,转录法,五,PCR,技术的应用,1,遗传疾病的诊断,人类镰刀型贫血症是因第六个密码子的第二个字母发生了,AT,的改变，从而导致该位点的谷氨酸为缬氨酸所取代,AT,突变还导致限制酶,Oxa,NI,位点的消失,利用,PCR,技术和限制酶谱分析诊断此分子疾病大致过程如下,DNA,扩增,PAGE,染色,观察,比较不同个体的结果,限制酶切,