细胞超微结构与电镜技术：透射电镜的原理和应用

1、透射电镜的原理和应用,透射电镜系统,光有波动性, 碰到物体会发生衍射. 光学透镜由玻璃制成, 通过不同外形角度,使光线折射,形成不同长短的聚焦像点 波长越短, 分辨率越高 电子在通过电场和磁场时,受到洛仑兹力的作用, 轨迹也发生弯曲,( 折射) 电子透镜一般分为静电透镜和磁透镜,电子在通过电场和磁场时,受到洛仑兹力的作用, 轨迹也发生弯曲,( 折射) 电子透镜一般分为静电透镜和磁透镜 （如图） 在这种静电场中， 前一半是电透镜，通过电透镜电子轨迹已向轴心折射。， 在通过后半个磁透镜（对称磁场）加速之后，形成的电子轨迹具有会聚的特性。,螺管线圈,螺管线圈,螺管线圈,照明系统组成：由电子枪、聚光镜

2、（1、2级）和相应的平移对中、倾斜调节装置组成。作用：提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度高、束斑小、束流稳定的照明源。为满足明场和暗场成像需要，照明束可在20-30范围内倾斜。 电子枪电子枪是电镜的电子源。其作用是发射并加速电子，并会聚成交叉点。 目前电子显微镜使用的电子源有两类：热电子源加热时产生电子，W丝，LaB6场发射源在强电场作用下产生电子，场发射电镜FE热阴极电子源电子枪的结构如图2-2所示，形成自偏压回路，栅极和阴极之间存在数百伏的电位差。电子束在栅极和阳极间会聚为尺寸为d0的交叉点，通常为几十um。 栅极的作用：限制和稳定电流。,(1)特点 物镜是一块强磁透镜，焦距很短，对材料

3、的质地纯度、加工精度、使用中污染的状况等工作条件都要求极高。致力于提高一台电镜的分辨率指标的核心问题,便是对物镜的性能设计和工艺制作的综合考核。尽可能地使之焦距短、像差小，又希望其空间大，便于样品操作，但这中间存在着不少相互矛盾的环节。 (2)作用 进行初步成像放大，改变物镜的工作电流，可以起到调节焦距的作用。电镜操作面板上粗、细调焦旋扭，即为改变物镜工作电流之用。 为满足物镜的前述要求，不仅要将样品台设计在物镜内部，以缩短物镜焦距；还要配置良好的冷却水管，以降低物镜电流的热飘移；此外，还装有提高成像反差的可调活动光阑，及其要达到高分辨率的消像散器。对于高性能的电子显微镜，都通过物镜装有以液氮

4、为媒质的防污染冷阱，给样品降温。,1.观察室 透射电镜的最终成像结果，显现在观察室内的荧光屏上，观察室处于投影镜下，空间较大，开有13个铅玻璃窗，可供操作者从外部观察分析用。对铅玻璃的要求是既有良好的透光特性，又能阻断X线散射和其他有害射线的逸出，还要能可靠地耐受极高的压力差以隔离真空。,成像原理,透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所產生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率為0.10.2nm，放大倍数為几万几十万倍。由於电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超

5、薄切片（通常為50100nm）。其制备过程与石蜡切片相似，但要求极严格。 组织要在机体死亡后的数分钟钓取材，组织块要小(1立方毫米以内），常用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋, 切成超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。称电子密度高。称电子密度高。反之，则称為电子密度低,透射电镜样品制备流程 由于透射电镜能观察的样品必须很薄（6070nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法： 一负染色技

6、术 负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。 样品要求： 样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。 尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。 操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色12min后滤纸吸去负染色液，待干后

7、用于电镜观察。,二、超薄切片技术 超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微 结构最常用的技术。广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10 100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节 ，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。具体操作步骤、注意事项如下：,1取材和前固定：快速的切取大小为0.51.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品） 块浸入2.5戊二醛（进口品

8、质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装 20个以上的样品块，作为一个样送到平台。 要求：取材前一定要和工作人员取得电话联系！取材选择部位要准确可靠，确保 每块材料都是要观察的部位。所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。泡在前固定液的材料最多可以放2周。,2漂洗：用1MPBSBufferPh7.2冲洗3次，每次15mins。 3后固定：加入1锇酸处理到样品变黑。植物样品一般处理2.5hours，真菌、细菌一般处理2hours，动物样品处理1hou

9、rs。注意事项：锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。锇酸比较昂贵，需特别节约使用。 4漂洗：用1MPBSBufferPh7.2冲洗3次，每次15mins。 5脱水：室温下，丙酮050708090每级作用30mins， 纯丙酮在作 用3次，每次作用30mins。 6渗透：其目的是使包埋剂逐步渗入组织细胞内。植物样品需要的渗透梯度多、渗透时间长。其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。以 二叶龄水稻叶片为例，其渗透流程如下：无水丙酮/包埋剂5：1作用12hours无水丙酮/包埋剂3：1作用12hours无水丙酮/包埋剂1：1作用12hours无水丙酮/包埋剂1：3作用12hours

10、无水丙酮/包埋剂1：5 作用12hours纯包埋剂作用45作用12hours。 注意事项：包埋剂为强致癌剂，特别要注意规范操作！ 7包埋：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中，45聚合12hours，60聚合36 48hours。,8超薄切片： 超薄切片的切片面积最大不能超过0.5mm0.3mm，比较难切的植物样 品要求切片面积更小。超薄切片是在超薄切片机上进行，但是切出比较理想的超薄切片，却是一件不容易的工作。做好需要有渗透、包埋好的包埋块，还要有好的切刀以及操作者的熟练技术等。超薄切片前期需要准备载网和支持膜、修块、制刀等， 前期准备工作至少需要半天时间。 超薄切片是极其精细、耗费眼力的工作，

11、需要静下心来慢慢操作，切好一个样品至少需要1小时。,9正染色：由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子 的散射能力很弱，相互之间的差别也很小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些 包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。因此生物样品超薄切片观察时像 的反差极弱。为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。 这里所谓电子染色是根本不同于光学显微镜的染色，它是利用重金属盐（如铅盐、铀盐等）与细胞的某些成分或结构结合，由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其结合的结构或成份对电子散射能力增强，从而达到提高样品本身反差的。目前最常用的染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色液。操作流程

12、是： 超薄切片先柠檬酸铅染色10分钟，去二氧化碳的双蒸水清洗3次，再用醋酸铀染色30分钟，双蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射电镜观察。注意事项：醋酸铀具有放射性，使用时要特别注意。柠檬酸铅染液极易和空气中的二氧化碳反应形成不溶解的黑色颗粒，污染切片。柠檬酸铅染液一定要现用相配，所用的双蒸水一定要煮沸除去二氧化碳。由于染色不可控制因素较多，产生污染的几率有40，所以每个样品的切片一定要留出铜网作备份。,电镜应用举例,正常细胞,凋亡细胞,正常线粒体,水肿线粒体,细胞自噬,嗜铬细胞瘤-分泌颗粒,乙肝病毒,肾小球,Ep,MC,RBC,MM,MC,En,En,肾小管,近端小管,近端小管,远端小管,神经纤维束,胶原纤维,病例,患者男性,16岁,因反复发作的泡沫尿2年余,近来加重3个月入院. 体检一般状态尚好, 脸面轻度浮肿, 心肺检查正常 尿检查: 蛋白尿 3+ , 红细胞31, 其他肾功能正常,肾穿刺组织光镜：4个肾小球，肾小球少数节段系膜细胞轻度增生伴基质轻度增多，个别节段与球囊壁粘连；肾小管