8第八章 重组体的筛选.ppt

1、第八章 重组体的筛选检测,一、核酸分子的遗传学与物理检测法 二、免疫化学与核酸序列分析法,将目的DNA片段与载体连接形成重组子，然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞，得到所需要的带有重组DNA的转化子，这是基因工程的目的所在,转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞,重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同水平进行鉴定,重组子的筛选,直接筛选,间接筛选,DNA鉴定,载体筛选,翻译产物,转录产物,其他方法,报告基因等,Northern blotting,Western blotting,标记补救筛选,质粒载体的互补筛选（蓝白色斑筛选

2、法,噬菌体包装容量的正性筛选,质粒载体的抗性标记筛选,同源性分析鉴定（原位杂交,DNA序列分析,重组子酶切图谱鉴定,重组子大小鉴定,一、遗传学检测法,1、根据载体表型特征的筛选,1）抗药性标记插入失活筛选法,第一节 核酸分子的遗传学与物理检测法,克隆Kan抗性基因,2） -半乳糖苷酶显色反应筛选法,蓝白菌落,蓝白菌落,筛选白色菌落,2、根据插入基因遗传性状的筛选,重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选,合成某一aa的基因,载体,酶切,连接,重组,缺少

3、该aa合成酶基因的菌株,转化,只缺少该aa的基本培养基,筛选,重组子,生长、获得,二、核酸分子的物理检测法,原理： 碱基配对 杂交双方： 待测的核酸序列 插入片段基因制备的DNA或RNA探针,核酸杂交方法： 菌落印迹原位（in situ）杂交 斑点（dot）印迹杂交 Southern印迹杂交 都是通过一定的物理方法将菌落（噬菌斑）或突起的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同液体中的探针进行杂交,1、菌落印迹原位杂交,将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确

4、反映组织细胞的相互关系及功能状态,实验步骤,Smad2 mRNA在系膜增生型IgA肾病肾小球的表达 原位杂交200,肺腺癌-cat mRNA 原位杂交法400,2、斑点印迹杂交,斑点印迹杂交与菌落原位杂交的原理相同 将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 常用于病毒核酸的定量检测,RNA或DNA 变性 NC膜 固定 杂交 放射自显影 检测,实验原理与步骤,提取,碱溶液,点样,加热,放射性探针,一定条件,X-底片,显影、定影,标记斑点,3、Southern 印迹杂交,1975年，英国Southern创建 DNA与DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到

5、固相支持物上，用探针进行检测的方法,带有DNA片段的凝胶,实验步骤,白瓷盘,玻璃板,滤纸,凝胶,尼龙膜,滤纸,吸水纸,玻璃板,重物,吸水纸转膜,用于分析混合DNA样品中是否存在能与特定探针杂交的序列。 Southern杂交由于滤膜是从凝胶上原位印迹而来，因而能够显示出与探针杂交的DNA片段的大小,用 途,Southern杂交定位kan抗性基因,4、直接凝胶电泳检测法,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量,分子量 Marker,载体,重组克隆,实验步骤,bp 1534 994 695 515 377 237,A B C M,5、酶

6、切电泳筛选法,原 理,根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度,用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果,A,B,A或B,不同克隆的酶切结果,筛选过程,第二节 免疫化学与核酸分析法,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式,一、放射性抗体检测法,1. 抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二 抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,125I

7、标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二抗 结合蛋白,125I标记的二抗,2. 放射性抗体检测法过程,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈,1. 原理,抗原抗体凝集反应,检测分泌型产物,2. 方法,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发,三、酶联免疫吸附测定（ELISA,Enzyme-linked immunosorbant assay,1. 原理,一抗（primary antibody

8、）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,2.ELISA的局限性,有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑,最好用单克隆抗体（monoclonal antibody,四、Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电

9、转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等,Western（转膜,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上,膜,胶,蛋白,Western装置,Blotting,原理与ELISA相同,待测蛋白,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物， 并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合,2）洗去未结合的一抗,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO,4）清洗掉未结合的二抗,5）用HRPO的底物浸泡膜,6）暗室里曝光，冲洗胶片,Blotting过程,结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗blotting结果,检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及