蔗糖酶的分离提纯

1、 蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1了解蔗糖酶分离提纯的方法。 2掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。【实验原理】蔗糖酶Ec 32126习惯命名-D-Fructofuranosidase系统命名：-DFructofuranosideffructonydrolase。 蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。它所催化的反应是：CH2OHHOHHHOHCH20HO蔗糖酶H OH OH H蔗糖 + H OH OH H 葡萄糖 果糖 蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。在微生物中，酵母中的含量很丰富。在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。研究表明采用菌体

2、自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE-纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。【实验材料、仪器和试剂】1实验材料和试剂(1)02葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母；(4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95乙醇；(8)DEAE-纤维素；(9)0.5molL NaOH；(10)0.5molL HCl；(11)0.005molL，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15molL NaCl的O.005molL，pH

3、6.0的磷酸钠缓冲液； (13)5蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 2仪器 (1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计； (9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【方法】 一、葡萄糖浓度标准曲线的制作 1取10支血糖管，按下表加入02葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨酸试剂：N0含糖量(mg)O2葡萄糖标准液(mL)水(mL)3,5-二硝基水杨酸试剂(mL)OD5401234567891000.40.81.21.62.02.42.83.23.600.20.

4、40.60.81.01.21.41.61.821.81.61.41.21.00.80.60.40.23333333333 上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。 2以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。二、蔗糖酶的分离提纯 1蔗糖酶粗品的制备 (1)自溶 称取10克干酵母，放在200mL的烧杯中，加30mL蒸馏水搅成糊状，再加入1.5克乙酸钠。然后在35水浴中搅拌30min，此时会观察到菌体自溶的现象。(2)提取及粗酶的制备 往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35保温过夜。第

5、二天，将自溶液于4500rmin离心20min。取出离心管，小心将上清液倒入烧杯中，弃沉淀。得到的上清液就是无细胞抽提液，即粗酶液（E1）。 量出粗酶液体积，记录。取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品（4保存）。 2乙醇分级 将粗酶液用稀醋酸调pH至4.5。 (1)32乙醇饱和度 按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32时所需乙醇体积。X1/（V+X1）=O.32式中X1为所需乙醇体积，V为粗酶液的体积。然后再按X10.95换算出使乙醇浓度(按体积)达32时所需95乙醇的体积。 把粗酶液和量好体积的95乙醇在冰盐浴中预冷(02)。小心缓慢滴加乙醇，同时不断搅拌，一定注意不要使乙醇局部过浓，否则

6、会引起酶变性失活。 在滴加乙醇过程中，酶液渐渐变混浊，滴加结束后，于3000rmin离心5min。上清转移到另一烧杯中待用，弃去沉淀。(2)47.5的乙醇饱和度 按下式算出使酶液乙醇浓度达475时所需乙醇的量 X2/(V+X2)=0.475式中X2为所需乙醇体积，V为粗酶体积。再按X20.95算出需95乙醇的体积。按下式可算出使乙醇浓度达475时所需补加的95乙醇体积。 X2/0.95- X1/0.95=使乙醇浓度达475时需补加的95乙醇体积 按前述方法，继续补加乙醇，使乙醇浓度达47.5于3000rmin离心3min，弃去上清会得少量沉淀。将沉淀用10mL pH6.0的0.005molL磷

7、酸钠缓冲液溶解，并对该液透析过夜或酌情缩短时间，中间换一次透析液。离心，则得到进一步纯化的酶。 量出酶液体积，取出2mL，待测活力和蛋白浓度。其他酶液准备上柱。3DEAE一纤维素柱层析 (1)DEAE一纤维素处理 在使用前，将市售的DEAE一纤维素按下述方法处理：用去离子水浸泡过夜，用浮选法除去过细部分，留下30min沉积部分，重复几次。然后用0.5molL NaOH，水，0.5molL HCl，水，0.5molL NaOH，水，交替浸泡。其中NaOH浸泡24小时，HCl浸泡半小时，每次抽滤后用水洗至中性。最后用0.005molL，pH60的磷酸钠起始缓冲液平衡。 再生方法：用过的DEAE一纤

8、维素可再生重复使用。但要先用0.5molL NaOH+0.5molLNaCl浸泡后再按常规处理。 DEAE一纤维素离子型。 水：R-N(CH3)2+H20=eRN+(CH3)2HOH- HCI：RN+(CH3)2HOH-+HCl=RN+(CH3)2HCl-+H20 NaOH：RN+(CH3)2HCl-+NaOH=RN+(CH3)2HOH-+Na+(2)装柱 本实验使用的层析柱规格为18cm(内径)15cm(高)。 把柱子垂直固定好，可用一千锤校正，按柱层析原理部分所述方法，把DEAE一纤维素装柱。床高距柱顶23cm为宜。用起始缓冲液洗柱，平衡过夜。注意控制流速，防止柱流干。(3)上样 乙醇分级

9、的酶液，经对起始缓冲液透析，离心后，按层析原理部分所述方法上样。（注意：流速要尽量慢，使目的酶和DE52充分吸附） 样品上完后，用起始缓冲液(130mL)洗柱。流出液流出速度为4mL5min左右。(4)洗脱 用含0.15molL NaCl的0.005molL pH6.0的磷酸钠缓冲液洗脱。洗脱速度4mL5min。收集20管即可结束。(34mL管)。 每隔一管测定活力，确定酶活力峰位置，合并，量出体积。测合并后制剂的活力和蛋白浓度。三、蔗糖酶的活力及蛋白浓度测定1蔗糖酶活力规定 在本实验的条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。2操作(1)样品的稀释 取0.2mL无细胞抽

10、提液(E1)用pH4.6，0.2molL NaAc缓冲液稀释40倍；取0.2mL乙醇分级酶液(E2)用上述缓冲液稀释80倍；DEAE-纤维素柱层析酶液(E3)根据情况稀释。 (2)反应 取两支试管分别加入2mL稀释的酶液。一支做对照，加0.5mL 1moLL NaOH，摇匀，使酶失活；另一支做测定管。然后把两支试管和5的蔗糖溶液放在35C水浴中预热恒温。 分别取2mL 5的蔗糖加入上述两试管中，并正确计算时间，3min于测定管中加入0.5mL1molL NaOH，摇匀，终止反应。 从反应混合物中取出0.5mL溶液放入血糖管中，加入3mL 3，5一二硝基水杨酸试剂和1.5mL水，摇匀。于沸水浴中

11、煮沸5min后立即用冷水冷却，加蒸馏水稀释到25mL刻度，摇匀，于540nm测光密度。 在葡萄糖标准曲线上找到所测光密度对应的葡萄糖含量，然后按下面活力计算公式计算酶活力。3酶活力计算公式 蔗糖酶活力单位：葡萄糖毫克数9酶的稀释倍数 式中9=4.5/0.5，因酶反应液的总体积是4.5mL，而用3，5一二硝基水杨酸试剂显色时仅取0.5mL。4蛋白浓度测定 E1稀释20倍；E2稀释4倍；E3不稀释。 Bradford法测蛋白浓度(见附注1)四、酶纯度鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定E1、E2和E3的纯度。【结果的处理】 样品样品总体积 ml总活力 蛋白浓度 mg/ml 总蛋白量 mg 比活 u/mg

12、 提纯倍数无细胞抽提液(E1)乙醇分级E2)DEAE一纤维素柱层析(E3)附实验1 Bradford法测定蛋白质含量 【实验目的】 掌握考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量的原理和方法。 【实验原理】 在蛋白质的分离、纯化过程中，往往需要有一种快速、灵敏的方法对蛋白质进行定量测定。近年来被广为采用的Bradford法满足了人们的需要。本方法采用考马斯亮蓝G250(Coomassilebrilliant blue，G250，简称CBBG250)作为染色物质。依其存在形式不同可表现为红色和蓝色，当CBBG250单独存在时为红色；当其与蛋白质结合后，其颜色变为蓝色。蓝色的深浅与溶液中的蛋白质含量(01

13、000g/mL)成正比，故可用于测定蛋白质含量。 该方法快速、重复性好、干扰因素少，CBBG250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在l小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的于扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠，Triton x一100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照来消除。【实验仪器与试剂】 1仪器 (1)台称 (2)721分光光度计 (3)容量瓶 (4)刻度试管和吸量管 2试剂 (1)考马斯亮蓝G250溶液：称取CBB-一G250 lOOmg溶于50mL 95的乙醇溶液中，然后加入100mL 85的磷酸，最后加蒸馏水定容至1000mL。 (2)标准蛋白

14、质溶液(100g/mL)：精确称取100mg牛血清白蛋白，用0.9氯化钠溶液定容至1000mL。 (3)生理盐水【实验操作】1制作标准曲线取6支试管，按下表操作管试 别 剂 空 白 1 2 3 4 5 标准蛋白质溶液(mL) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 生理盐水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 CBB-G250溶液(mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀，放置2min，于595nm处比色，记录光密度值(OD值)。以蛋白质含量为横坐标，光密度值(OD值)为纵坐标，绘制标准曲线。 2样品测定取2只试管，按下表操作：管试 别 剂 样品管 空白管 稀释的

15、未知样品(mL) 1.0 生理盐水(mL) 10 CBB-C250溶液(ml) 5.0 5O 混匀，放置2min，于595nm处比色，查标准曲线，求得蛋白质含量。注：样品用生理盐水稀释。 附实验2聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶的纯度【实验目的】 掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法和原理。【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的三维网状结构的高分子聚合物，其网孔大小可由凝胶浓度加以调节。因此用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物时，被分离物质由于所载电荷及其分子大小和形状的差异，在电场作用下以及凝胶网孔的“分子筛”作用下产生不同的移动

16、速度而互相分离。所以此方法具有电荷效应和“分子筛”效应的双重特性。因为这一方法具有设备简单、操作方便、时间短、样品用量少、不易扩散等优点，所以它是鉴定酶和分离蛋白质的有力工具。【实验仪器与试剂】1仪器(1)SCR型稳流稳压电泳仪(2)垂直板电泳槽及附件(3) 10mL注射器、100L、10L移液器(4)微量注射器、烧杯、移液管(5)真空泵2试剂(1) pH8.9 Tris-HCl缓冲液（1号）：称取Tris 36.6g，lmolL HCl 48 mL，TEMED 0.23mL，加重蒸馏水定容至100mL。(2)凝胶贮液（2号）：称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸馏水分别溶解，定

17、容至100mL，过滤，棕色瓶4贮存可使用2周。(3) 0.14%过硫酸铵(3号): 称取(NH4)2S206 0.14g，加重蒸馏水定容至100mL(现用现配)(4) pH6.7 Tris-HCl缓冲液(4号)：称取Tris 5.98g， lmolL HCl 48 mL，TEMED 0.46mL，加重蒸馏水定容至100mL。(5) 电极缓冲液(pH8.3)：称取甘氨酸28.8g，Tris 6.0g，加重蒸馏水定容至1000mL， pH为8.3（使用时稀释10倍）。(6) 0.1%溴酚蓝指示剂：(7) 染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，甲醇227mL，冰乙酸46 mL，加蒸馏水定容至500

18、mL。(8) 脱色液：甲醇50mL，冰乙酸75 mL，加蒸馏水定容至1000mL。【实验操作】 1分离胶的制备（7.5%）：1号贮液：2号贮液：蒸馏水：3号贮液按l：2：1：4配制(TEMED 20l) 将1、2及水按比例混好后置于三角瓶中，再放在真空干燥器中，同时将3液也放在真空干燥器中减压排溶液中的气泡。抽气后立即按比例加入3号液，用玻璃棒轻轻搅拌使之混合。用滴管将其沿管壁注入到已用琼脂封好的垂直板凝胶模具两玻璃夹层中，注意要缓慢，避免产生气泡。当凝胶溶液顶部距玻璃板上端4cm时为止，然后在凝胶溶液顶部轻轻加约0.5cm厚的蒸馏水层，当夹层中的凝胶与水层之间出现清晰的界面时，表明凝胶聚合作

19、用已完成，通常需0.5-1h。2浓缩胶制备（3%）： 4号贮液(1.25mL), 2号贮液(1.0mL), 3号贮液(8mL) (TEMED 15L)混匀，将分离胶顶部的水层吸出，把配好的浓缩胶加到分离胶上面，再将梳板插到浓缩胶层，静置，待凝胶聚合后，于室温放置半小时以上方可使用。3加样 小心取出梳板，用滤纸条吸去槽内水分，于两电极槽内加入电极缓冲液，用微量加样器加样，每孔各加20l左右，最多可加100l。注：E1、E2、E3各100L加200L 40%蔗糖，再加50L溴酚蓝混匀上样20L。E3若含量低可200L。4电泳 加样后，打开电源开关，将电流调50mA，当染料进入浓缩胶与分离胶界面时将

20、电流调至75mA，电压100-200V，待染料迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。电泳时间约4-4.5h。5染色和脱色 将凝胶放入染色液中，过夜。次日，倒出染色液，用蒸馏水洗凝胶数次后，放入脱色液中，更换脱色液，直至背景清晰。附实验3 蔗糖酶米氏常数的测定【实验目的】 了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习求蔗糖酶米氏常数的方法。【实验原理】 测定米氏常数最常用的方法是双倒数作图法：1Km1SVmaxVmax1实验时，选择不同的s，测定相应的v，求出两者的倒数，以1/s为横坐标，以1/为纵坐标作图，绘出一条直线(图1)，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km。此法由于方便而应用最广，但亦有

21、缺点，实验点过分集中于直线的左端，因而作图不易十分准确。 1/ 斜率Km/Vmax 1/Vmax -1/Km 1/s【实验仪器与试剂】1仪器(1)721分光光度计；(2)恒温水浴；(3)试管、吸量管、秒表、坐标纸、血糖管2试剂 (1)0.1 molL蔗糖溶液；(2)0.2 molL NaAc缓冲溶液(pH4.6) (3)1molL NaOH溶液，2molL NaOH溶液 (4)3，5一二硝基水杨酸试剂 称取10g 3，5一二硝基水杨酸溶于200mL 2molL NaOH中，加入300g酒石酸钾钠4H20，再用去离子水稀释至2000mL。【实验操作】 1取试管10支，按110编号，1号为空白。 2按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入10支试管中，于35水浴中保温10min。 3取约25mL酶液，放入同一水浴中保温约10min。 4于各管中依次按同样时问间隔(1min或2min)加人已保温过的酶液2mL，计时，立即摇匀，在35水浴中作用5min。 5按同样次