农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程

1、ICS65.020.20B 05DB15内蒙古自治区地方标准DB 15/ TXXXX农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程Technical Regulation for Agrobacterium-mediated Sugarbeet Genetic Transformation点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/ TXXXX前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本标准由内蒙古自治区农业标准化技术委员会(SAM/TC 20)归口。本标准起草

2、单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本标准主要起草人：张自强、白晨、李晓东、张惠忠、王良、韩平安、张必周、付增娟、赵尚敏、鄂圆圆、郑文哲、张辉。5农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程1 范围本标准规定了农杆菌介导甜菜遗传转化的相关技术要求。本标准适用于农杆菌介导甜菜遗传转化的全过程。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1种球 bulb甜菜通过杂交形成的种子。2.2遗传转化genetic transformation此处指异源的质粒被人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。2.3侵染infection农杆菌进入并感染甜菜外植体的过程。2.4叶片-叶柄leaf-petiole甜菜无

3、菌苗叶片和叶柄相连接的部位，长约 1 cm。3 培养基配置3.1 琼脂粉培养基用于甜菜种球的萌发。具体成分为（1 L）：琼脂粉7.5 g。3.2 诱导分化培养基用于甜菜无菌苗诱导分化培养。具体成分为（1 L）：MS培养基4.75 g，蔗糖30 g，NAA（萘乙酸）0.7 mg，KT（激动素）1.2 mg，琼脂粉7 g。3.3 继代培养基用于甜菜无菌苗的继代培养。具体成分为（1 L）：MS培养基4.75 g，蔗糖30 g，NAA 0.5 mg，KT 0.4 mg，琼脂粉7.5 g。3.4 生根培养基用于甜菜无菌苗的生根培养。具体成分为（1 L）：MS培养基4.75 g，蔗糖30 g，NAA 1.

4、2 mg，琼脂粉7.5 g。3.5 YEP培养基用于农杆菌的增值培养。具体成分为（1 L）：牛肉浸膏5 g，酵母提取物10 g，氯化钠5 g，琼脂粉15 g，rif（利福平）50 mg，kan（卡娜霉素）50 mg，pH=7.0。3.6 侵染液培养基用于加入农杆菌菌液配制侵染液。具体成分为（1 L）：MS 培养基 4.74 g，蔗糖 30 g，NAA 0.7 mg，KT 1.2 mg，AS(乙酰丁香酮)150 M，pH=6.8。3.7 预培养培养基用于甜菜叶片-叶柄的预培养。具体成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖30 g，琼脂粉7.5 g，NAA 0.7 mg，KT 1.2 mg，

5、pH=5.8。3.8 共培养培养基用于侵染后甜菜叶片-叶柄与农杆菌的共培养。具体成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖30 g，琼脂粉7.5 g，AS 150 M，NAA 0.7 mg，KT 1.2 mg，pH=5.8。3.9 脱菌培养基用于共培养后的脱菌。具体成分为（1 L）：MS培养基 4.74 g，蔗糖30 g，琼脂粉7.5 g，rif 500 mg，kan 50 mg，pH=5.8。3.10 筛选培养基用于甜菜转化后的筛选培养。具体成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖30 g，琼脂粉7.5 g，草甘膦0.08 M，pH=5.8。4 灭菌与萌发4.1 灭菌前准备配制75

6、 %酒精，配制0.1 %升汞，制备灭菌水。4.2 种球灭菌将磨掉花萼完整的甜菜种球，用百菌清（烟剂型）密闭熏蒸24 h后，在超净工作台中移至灭过菌的三角瓶中，随后用75 %酒精消毒2 min，灭菌水漂洗3 次，接着用0.1 %的升汞处理20 min，灭菌水漂洗3 次，最后将消毒后的种子接种于琼脂粉培养基上。4.3 种球萌发置于组培室培养，23 条件下进行培养，7 d10 d即可萌发。待芽长2.0 cm2.5 cm左右时，带子叶一起切下，接种到新的继代培养基中。培养环境：温度23 ，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。培养20 d25 d成苗。5 无菌苗培养5.1 诱导分化培养在超净工作

7、台上，将无菌苗置于无菌培养皿中，用灭菌后的手术刀将无菌苗的叶片-叶柄切下，长度为0.8 cm1.2 cm的小段，随后将叶片-叶柄接种于诱导分化培养基中进行分化诱导培养。切去叶片-叶柄的无菌苗去除老化部分接种于继代培养基中继续培养，供以后切去叶片-叶柄使用。叶片-叶柄和无菌苗培养环境：温度23 ，光照强度3000 Lux，光照时长为14 h。5.2 继代培养当诱导的丛生芽长到1 cm2 cm，在超净工作台中将丛生芽分切为单苗，接种于培养基中进行继代培养。培养环境：温度 23 ，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。6 侵染液制备与叶片-叶柄预培养6.1 菌液活化超低温冰箱中取出冷冻含有目的

8、基因的农杆菌EHA105 C58（rif R）Ti pEHA105（pTiBo542DT-DNA）（strep R）Succinamopne）菌液，将菌液在YEP培养平板中划线培养，培养温度28 ，培养时间14 h。6.2 制备侵染液将培养好的农杆菌刮下来，放置侵染液培养基中重新悬浮，使其OD600值在0.300.50之间，然后冰浴1 h，备用。6.3 叶片-叶柄预培养把从甜菜无菌苗上切下的叶片-叶柄，放在预培养培养基上进行预培养，预培养环境：温度23 ，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。预培养时间2 d6 d。7 遗传转化7.1 叶片-叶柄预处理预培养后的叶片-叶柄，沿其茎走向用手

9、术刀划出伤口，伤口的深度以不切透叶片-叶柄为准。7.2 农杆菌侵染将预处理后的叶片-叶柄放入侵染液中，使用真空泵抽真空，使叶片-叶柄完全浸入侵染液，侵染20 min30 min。7.3 共培养从侵染液中取出叶片-叶柄，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放入共培养培养基中，进行共培养。培养环境：温度23 ，暗培养。培养时间3 d6 d。7.4 脱菌培养共培养后，将叶片-叶柄放入脱菌培养基中，进行脱菌。培养环境：摇床转速125 rpm，温度25 ，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。脱菌2 d3 d。7.5 筛选培养脱菌培养后，从脱菌培养基中取出叶片-叶柄，放入筛选培养基中，放入培养室培

10、养。培养环境：温度25 ，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。培养15 d20 d，从部分叶片-叶柄上可长出小芽，进一步培养成转基因甜菜无菌苗。8 生根培养从筛选培养基中取出成苗，将生长健壮的丛生芽块切成1 cm2 cm的单芽，接种到生根培养基中，培养环境：温度25 ，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。20 d30 d即可诱导出新生根。9 移栽9.1 炼苗去掉封口膜，在组培室锻炼2 d3 d。9.2 室内移栽选择根系生长健壮的无菌苗，用自来水浸泡根部培养基12 h，然后取出无菌苗洗净根部残留培养基，移栽到花盆中并用烧杯扣住，定期浇水，室内培养7 d14 d，移去烧杯。9.3 大田移栽待盆栽幼苗生长健壮，平均气温稳定在