流式淋巴细胞亚群检测技术原理

1、淋巴细胞亚群检测,目录,1,淋巴细胞的分类,2,淋巴细胞亚群检测方法,3,淋巴细胞亚群检测原理,4,淋巴细胞亚群的免疫功能,5,淋巴细胞亚群的临床意义,T淋巴细胞,细胞免疫,B淋巴细胞,体液免疫,NK细胞,固有免疫,淋巴细胞的分类,淋巴细胞占外周血白细胞总数的20%-40%,检测方法,采用流式细胞术（FCM） 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术,FCM,检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行

2、分选；,荧光抗体,直接标记,第一抗体,荧光二抗,间接标记,免疫荧光染色主要有两种方法。间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂，所以一般首选直接荧光染色,检测原理,常用荧光素,499nm 蓝色荧光（Blue） 500-549nm，绿色荧光（Green） 550-584nm，黄色荧光（Yellow） 585-615nm，橙色荧光（Orange） 616-700nm，红色荧光（Red） 700nm，远红外荧光（Far-Red）,常用荧光素,免疫荧光染色,FCM可检测下列细胞成分： 表面标记物 胞浆标记物 核内标记物 可溶性成分,联合CD45的四色方案,第一种是用CD45/CD3/CD4/CD8

3、做四色标记，主要可以检测T3细胞、T4细胞、T8细胞这三种不同的亚群 CD45-FITC CD4-RD1 CD8-ECD CD3-PC5,联合CD45的四色方案,第二种是用CD45/CD3/CD19/CD16和（或）CD56做第二管的标记，用于检测T3细胞、B细胞和NK细胞 CD45-FITC CD56-RD1 CD19-ECD CD3-PC5,检测目的,相互协作共同参与,1,2,3,功能,比例,数量,T、B细胞相互作用,主要检测项目,淋巴细胞,总T细胞,T4细胞,T8细胞,NK细胞,B细胞,总T淋巴细胞,CD3+,T4细胞,CD3+CD4+CD8-,T8细胞,CD3+CD8+CD4-,B细胞

4、,CD3-CD19+,NK细胞,CD3-CD（16+56）+,淋巴细胞的免疫标志,总T细胞增高,提示体内的T细胞免疫功能增强 见于临床某些自身免疫性疾病（如SLE）、重症肌无力、慢性活动性肝炎、甲状腺功能亢进、淋巴细胞性甲状腺炎、器官移植排斥反应、T细胞性白血病等,总T细胞降低,提示体内的T细胞免疫功能减弱 见于某些白血病、应用免疫抑制剂药、放疗过程中、先天性细胞免疫缺陷、艾滋病、多发性骨髓瘤、传染性单核细胞增多症，以及过劳等造成机体免疫功能处于相对较低的其他一些情况,T4细胞增高,提示体内存在细菌等病原微生物感染，主要见于临床各种细菌性感染性疾病。 器官移植发生排斥反应 支气管哮喘 SLE活

5、动期 某些免疫增强药物的有效结果 注意:昼夜变化（傍晚的峰值可为上午的两倍）,T4细胞降低,提示体内存在病毒等病原微生物，主要见于临床各种病毒感染性疾病，以HIV感染时减少最为明显 T4细胞减少也可见于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、严重联合免疫缺陷病、严重创伤、大手术等,T8细胞,主要功能：特异性直接杀伤靶细胞 两条途径：一是分泌穿孔素、颗粒酶及淋巴毒素 等直接杀伤靶细胞 二是通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡。,杀伤特点： 连续性杀伤 特异性杀伤 MHC限制性,T8细胞增高,提示体内存在病毒或胞内寄生菌等病原微生物感染 主要见于HIV、HBV、CMV、EB等病毒感染 也可见于结核杆菌感染

6、等,T8细胞降低,移植排斥反应 可见于免疫球蛋白缺乏症 胸腺发育不良 严重联合免疫缺陷病 糖尿病等,T4/T8细胞比值增高,是T4淋巴细胞增高或T8淋巴细胞减少所致 见于某些自身免疫性疾病，如SLE、多发性硬化、器官移植排斥反应、自身免疫性溶血性贫血等,T4/T8细胞比值降低,是T4细胞减少或T8细胞增高所致 见于艾滋病、再生障碍性贫血、某些白血病、传染性单核细胞增多症、免疫缺陷综合征、某些病毒感染、恶性肿瘤、结核病等 一般来说，导致T4/T8比值倒置，以全身性、侵袭和破坏机体免疫系统的感染引起的倒置变化幅度最大 临床抗感染治疗有效时，可以观察T4/T8细胞比值的逐步恢复,T4/T8细胞比值临

7、床意义,器官移植受者免疫功能监测 个体化免疫治疗疗效判断 受者需要的是一种恰当的免疫抑制，将免疫功能控制在较低的一个范围内。 需要经常性监测受者的免疫功能，T4/T8细胞比值是非常好的一个监测指标 当受者T4/T8细胞比值出现小于0.2的情况时，必须立即停用免疫抑制药，等待免疫功能的适当恢复,T4/T8细胞比值与肿瘤,恶性肿瘤患者术前T4/T8细胞比值低，手术后比值恢复正常 当发生癌转移时,T3、T4细胞数明显减少的同时T8细胞数明显增多 T4/T8比值明显降低,提示恶性肿瘤患者晚期细胞免疫功能更低,预后更差,产生抗体,提呈抗原,免疫调节,B细胞的功能,B细胞增高,提示机体体液免疫功能被增强

8、此时体内高亲和力抗体的产生也增加 见于临床各种细菌性感染 B细胞增高也见于B细胞白血病,B细胞减少,见于原发及继发性免疫功能低下，临床可出现反复发作的呼吸道及消化道感染 见于严重病毒性感染、使用免疫抑制剂制药等情况 见于原发性B细胞缺陷病（如性联无丙种球蛋白血症）和重症联合免疫缺陷（T细胞同时缺如） 体液免疫功能不良者则减少 在生命垂危时可呈现极度减少,自然杀伤细胞,表面标记 CD3-、CD56+、CD16+ 表面受体 （1）杀伤细胞活化受体（KAR） 结合靶细胞表面糖类配体，促使NK发挥杀伤作用。 （2）杀伤细胞抑制受体（KIR） 识别自身细胞表面MHC-I类分子，产生抑制信号 无须致敏即直

9、接杀伤靶细胞,抗感染与抗肿瘤,免疫调节,NK细胞作用及效应机制,抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC） 天然细胞毒性 NK细胞介导的凋亡 NK细胞产生的细胞因子 NK细胞受体,NK细胞通过ADCC作用杀伤病毒感染的靶细胞,NK细胞杀伤靶细胞电镜图,NK细胞,NK细胞是机体抗某些病毒、细菌、寄生虫、真菌感染的重要免疫因素，NK细胞异常在病毒感染时尤其突出。 NK细胞减少见于萨科奇病毒、脑心肌炎病毒、流感病毒、EB病毒、HSV-型等感染。 NK细胞也参与型超敏反应和移植物抗宿主反应，IL-2治疗后外周血NK细胞数量增加。,NK细胞,NK细胞与肿瘤性疾病的发生、发展和转归密切相关 一般而言，肿瘤患者NK细胞数量较正常人减少，且减少的程度与肿瘤病情的严重程度密切相关，病情好转，NK细胞数量回升 因此，N