基因转染技术及其应用简介.ppt

基因转染技术及其应用简介,报告人:陈红平2006年11月,安德鲁法尔和克雷格梅洛,报告内容,一、基因转染简介二、基因转染的基本方法三、基因转染技术的应用,1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。,一、基因转染简介,二、基因转染的基本方法,(一)重组子构建(二)基因转染真核细胞的基本方法,(一)重组子构建,1.目的基因的制备和获取2.哺乳动物细胞表达载体的选择3.DNA片断的重组连接4.DNA重组体的鉴定,(1)目的基因是所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段(2)目的基因常用的制备方法,1.目的基因的制备和获取,A.限制酶切除a.从原核基因组DNA制备视原核基因组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。b.从真核基因组DNA制备c.从已克隆的DNA片段制备,B.PCR或RT/PCR方法制备目的基因a.获取已知基因据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知）设计/合成一对引物PCR（基因组DNA为模板）/RT-PCR(mRNA为模板)从组织或细胞制备目的基因b.构建RT/PCR文库法获取未知基因据mRNA末端如polyA尾设计共同引物将所用mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体构成PCRcDNA文库筛选,C.计算机克隆即利用GenBank信息，利用不同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因片段，这有赖于各种计算机软件的应用。D.化学合成法制备基因片段用DNA合成仪，对目的基因分段合成，连接，可以得到所需的目的基因。,2.哺乳动物细胞表达载体的选择,哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒型载体（1）质粒型载体哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。A.典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件:a.启动子b.增强子c.多聚腺苷酸化信号d.药物选择标记基e.报告基因f.表位标签,B.常用的哺乳动物表达质粒载体a.pcDNA3.lb.pSIc.pCMV-HAd.pBudCE4.1e.pTRE,（2）病毒型载体病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应用的病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等。A逆转录病毒载体逆转录病毒的优点是，可以使外源基因整合到基因组中，因而可以被稳定传代和表达。但是，由于逆转录病毒的插入位点是随机的，因而在基因组内的整合有可能破坏一些内源基因的结构，尤其是当插人到一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。,B.腺病毒载体易于培养、纯化，在感染过程中复制与转录依赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较大的外源基因片段，且腺病毒基因不会发生整合，是研究真核基因的良好模型。,3.DNA片断的重组连接,4.DNA重组体的鉴定,外源DNA片断是否插入载体构成重组DNA分子，而插入片断大小，是否突变及插入位置，顺序及方向则关系到构建载体是否扩增，我们所需要的基因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴定DNA重组体（1）酶切鉴定是必需的，基于下述:A.限制性图谱个体特异性，不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱不一样。B.同一载体连接不同的DNA片断，不同的载体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不同的。C.插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点)酶切，一般来说用3种限制酶切：可鉴定载体及插入片段的大小,方向,切后并电泳分析,以确定是否得到预期的rDNA。,（2）若构建DNA重组体是为了克隆某个基因，可进行在序列测定。（3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。,对外源基因转染方法的要求包括：转移效率高，不影响细胞的正常生理活动，低毒性，容易使用，重复性好，易获得稳定转化子。根据转染的机制不同可将转染法分为：1.化学转染法2.物理转染法3.病毒感染法,(二)基因转染真核细胞的基本方法,1.化学转染法,化学转染法包括DEAE一葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法等。目前应用最广泛的是人工质体法。1.DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。,2.磷酸钙共沉淀转染法由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定染的研究。方法是，先将DNA和氯化钙混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人DNA。3.人工脂质体法脂质体还可以介导DNA和RNA转动物和人的体内，用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体与带负电荷的核酸结合后形成合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内。,2.物理方法,包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。（1）电穿孔法利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。,（2）显微注射法该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。（3）基因枪法该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。,3.病毒感染法,病毒颗粒是一类十分有效的基因释放系统，因此，它是将外源基因导人大量细胞最有效的方法。病毒感染具有高效率、可稳定遗传、适用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。但多数病毒有其潜在的危险性，操作者需要有一定的病毒操作经验和良好的设施。（1）逆转录病毒（2）腺病毒,三、基因转染技术的应用,（一）转基因植物（二）转基因动物（三）生物制药（四）基因治疗（五）RNAi技术,（一）转基因植物,1.转基因植物的发展简史2.转基因植物类型,1.转基因植物的发展简史,（1）1983年，世界第一例转基因植物烟草问世（2）19962005年，全世界转基因植物在21个国家种植，面积从1996年的170万公顷增加到2005年的9000万公顷（3）全世界转基因作物仅种子销售额到2005年已达52.5亿美元，是1995年的63倍,2.转基因植物类型,（1）抗除草剂基因（2）抗虫基因（3）抗病基因（4）抗逆境基因（5）改良品质基因,（二）转基因动物,1.转基因小鼠2.转基因牛3.转基因猪4.转基因动物疾病模型,转基因动物疾病模型,1.转基因动物与心血管疾病a.与动脉粥样硬化和脂质代谢有关的如LDL受体转基因动物可增强LDL的清除；b.apoE3基因转基因鼠可增强LDL的清除，而突变的apoE则诱发高脂血症，apoE4与apoE7转基因鼠还出现学习与记忆能力降低、诱发肿瘤以及脾脏、肾脏肿大等。2.转基因动物与高血压与血压调控有关的如reninangiotensinogen转基因鼠模型出现高血压，用于研究RAS(reninangiotensinogensystem)中各成分致高血压的作用以及相互关系,3.转基因动物与乙型肝炎乙型肝炎是目前流行广泛、危害严重的病毒性传染病。由于一般实验动物对HBV不易感，目前发现能够感染HBV的动物只有灵长类，因此使得对HBV致病机理的研究很难用动物实验的方法来进行。HBV转基因小鼠的建立，为探讨HBV的致病机理提供了有价值的动物模型4.转基因动物与肿瘤研究转基因鼠肿瘤模型能很好地模拟体内的生理、病理环境，与所要研究肿瘤的发生过程具有较好的一致性，而且可模拟部分癌前病变。,（三）生物制药,1.细菌细胞2.酵母细胞3.昆虫细胞4.哺乳动物细胞5.动物乳腺反应器,动物乳腺反应器,是指利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并能从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。特点：1.对转基因动物的影响小2.产量大，产品易提纯，质量高3.表达产物生物活性稳定4.易于扩群，进行规模化生产5.缩短新药上市周期6.可以获取巨额经济利润,（四）基因治疗,1.基因治疗(genetherapy)是指将外源功能性目的基因导入病人体内，通过调控目的基囚表达，抑制、替代或补偿缺陷基囚，从而恢复细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗目的的一种方法2.治疗方式：（1）基因直接注射法(invivo)：即经静脉或肌肉直接将带存外源DNA的病毒、脂质体或裸露的DNA注入患者有关组织，使其进入相应的细胞并表达。（2）体外基因转移再回输体内的方法(exvivo)：即将患者的体细胞(如T淋巴细胞)取出在体外培养并导入外源目的基因后重新输回患者体内。,3.基因治疗的策略（1）基因置换（2）基因补偿（3）基因失活（4）免疫基因治疗（5）活化前体药物基因治疗（6）耐药基因治疗,（五）RNAi技术,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006,RNAi,一、RNAi早期研究和理论形成二、参与RNAi的重要分子三、RNAi作用机制,一、RNAi早期研究和理论形成,(一)、RNAi早期研究1、牵牛花实验1990年，Arizona大学的Rich教授在转基因实验室将紫色素基因导入至矮牵牛花植物，目的是想通过增加紫色素基因拷贝获得具有更多的紫红色的矮牵牛。结果出乎意外，增加花瓣紫色的着色失败，一些转基因的花出现全白或部分白花，色素合成不是增加了，而是减少了，事实上，不仅导入的基因未被表达，反而植物本身的基因也失活或受到某种程度的限制。这种现象称为共抑制（cosuppression)现象。,2020/6/12,山西医科大学生化教研室,37,2.秀丽线虫实验,1995年，Cornell大学SuGuo和Kemphues试图以反义RNA技术特异性地阻断秀丽线虫par-1基因的表达以研究其功能。发现，给线虫注射par-1的反义RNA时，如预期那样阻断了该基因的表达；但当给对照组注射正义RNA以期观察到该基因表达增强时，却发现par-1基因同样也被抑制了。,3.粗糙脉孢菌实验,1997年，意大利Cogoni等，将外源类胡萝卜素基因导入真菌粗糙脉孢菌（结果引起30%被转化的脉孢自身基因失活，转化细胞中内源性胡萝卜素基因也受到了抑制，这种基因失活形式称之为抑制（quelling,基因压制）。,早期的三个实验，牵牛花实验和粗糙脉孢菌实验已经做出了有意义的结果，但都没有继续研究。其中以秀丽线虫实验有最有意义，因为在这个实验中给线虫注射了正义RNA和反义RNA，但就是没有注射二者结合起来的双连RNA。而RNAi理论形成的形成正是基于后者。,（二）RNAi理论形成,1.RNAi理论2.RNAi概念,DiscoveryofRNAi,Double-strandedRNA,inject,C.elegans,Neg.controlUninjected,AntisenseRNAdsRNA,sense,antisense,Nature1998,391:806-811,Mex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization,1.RNAi理论,1998年，Fire和Mello运用asRNA、sRNA及dsRNA进行研究，结果非常令人吃惊，在使相应的C.elegans基因沉默上，dsRNA的抑制效能比单一的有义或反义均有效，诱导基因沉默的效率高10倍。少量的dsRNA处理线虫就能呈现基因沉默现象，该抑制现象还可传给第二代。,2.RNAi概念,RNAi是指一些小的双链RNA序列导入机体或细胞中，机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到高效特异的抑制或阻断（沉默），因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS),二.参与RAN干扰的重要分子,（一）Dicer酶（二）RISC（三）RdRP和mRNA,（一）Dicer酶,Dicer酶是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，促使dsRNA裂解为小片段RNA即短干扰RNA(shortinterferenceRNA，siRNA)的重要因子,（二）RISC,1.RISC：RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencin