细胞生物学最新版

.,教学内容：一、细胞的结构与功能细胞的统一性和多样性；真核细胞的结构（主要细胞器、细胞骨架）二、细胞的生活和调控细胞的增殖、分化、衰老和死亡；细胞信号转导三、基因组的维持真核基因组的结构、染色质结构及其调控；DNA的复制、修复和转座四、基因组的表达和调控转录、翻译的机制；原核和真核生物的基因调控；调控RNA五、分子及细胞生物学研究技术,.,基因组的维持,真核基因组的结构染色质结构及其调控DNA的复制、修复和转座,.,真核基因组的结构,4,1,3,5,DNA的结构与功能核小体基因与基因组,.,核酸（nucleicacid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子。天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA)，另一类为核糖核酸（ribonuleicacid,RNA)。DNA存在细胞核和线粒体内，携带和传递遗传信息，决定细胞和个体的基因型（genetype)。RNA存在于细胞质和细胞核内，参入细胞内DNA遗传信息的表达。病毒中，RNA也可作为遗传信息的载体。,.,Section1DNA的结构与功能,一、DNA的一级结构,4种核苷酸的连接及排列顺序四种脱氧核糖核苷酸分别表示为：dAMP、dGMP、dTMP、dCMP,.,Nucleoside,.,DNA是双螺旋的生物大分子。生物信息绝大部分都贮存在DNA分子中。这些信息以核苷酸不同的排列顺序编码在DNA分子上，核苷酸排列顺序变了，它的生物学含义也就不同了。DNA的一级结构就是指核苷酸在DNA分子中的排列顺序。因此测定DNA的碱基排列顺序是分子生物学的基本课题之一。,1.DNA一级结构中贮存的生物遗传信息,.,DNA分子的多样性碱基的排列顺序，而构成了DNA分子的多样性100bpDNA分子可能排列方式就是4100DNA中的碱基排列顺序是DNA分子的重要属性,.,4种dNTP以3、5磷酸二酯键相连构成一个没有分枝的线性大分子。（与蛋白质比触觉不灵）。它们的两个末端分别称5末端（游离磷酸基）和3末端（游离羟基）。,2、DNA一级结构的基本特点,.,二、DNA的二级结构,1）主链脱氧核糖和磷酸基相互连接构成DNA的主链。从化学键的方向来看，双螺旋中两条多核苷酸链是反向平行的。二条主链处于螺旋的外侧，碱基处于螺旋的内部，由于糖和磷酸根的化学性质，主链是亲水的。两条链形成右手螺旋，有共同的螺旋轴，螺旋的直径是20A。,1.双螺旋的基本特征,.,Schematicmodel,Space-fillingmodel,.,右手双螺旋构象是DNA最为常见的结构-B型DNA。DNA二级结构可分为两大类：一类是右手螺旋，如：B-DNA、CDNA、D-DNA、E-DNA、A-DNA；另一类是局部的左手螺旋，即Z-DNA。,Watson和Crick于1953年根据DNA纤维X射线晶体衍射图，提出了DNA为右手双螺旋结构的科学假设,.,A,B,Z,.,在A-T丰富的区段，DNA常呈现B-DNA。在转录状态，DNA与RNA的杂合链呈现A-DNA。虽然B-DNA是最常见的构象，但是A-DNA和Z-DNA似乎具有不同的生物活性。,.,PropellerTwist,Buckle,Textbook,RealLife,.,2）碱基对,这两种碱基对（A/T,G/C）有一个重要的特征，就是它们具有二次旋转对称性，即一对碱基对旋转180O,并不影响双螺旋的对称性，因此双螺旋结构只限定了配对的方式，并不限定碱基的顺序。碱基环是一个共轭环，本身构成一个平面分子。在双螺旋中这个平面垂直于螺旋轴，相邻的两个碱基上下间隔3.4A,每十对碱基组成一节螺旋，因此双螺旋的螺距是34A。一条链中每个相邻的碱基方向相差360。碱基之间的疏水作用可导致碱基堆集，这个引力同碱基对之间氢键一起稳定了双螺旋结构。,.,沿螺旋轴方向观察，配对的碱基并不充满双螺旋的空间。由于碱基对的方向性，使得碱基对占据的空间是不对称的，因此在双螺旋的表面形成二个凹下去的槽，一个槽大些，一个槽小些分别称为大沟和小沟。双螺旋表面的沟对DNA和蛋白质的相互识别是很重要的，因为在沟内才能觉察到碱基的顺序，而在双螺旋的表面，是脱氧核糖和磷酸重复结构，没有信息可言。,3）大沟和小沟,.,.,决定DNA双螺旋结构状态的因素主要有以下几点：氢键碱基堆积力带负电荷的磷酸基的静电斥力碱基分子内能,.,DNA三股螺旋构型称为H-DNA，是在DNA双螺旋结构基碱上形成的。它是双螺旋DNA分子中一条链的某一节段，通过链的折叠与同一分子中DNA结合而形成。三条链均为同型嘌呤或同型嘧啶，即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶，其中两条链为正常双螺旋，第三条链位于双螺旋的大沟中。H-DNA可在转录水平上阻止基因的转录，这就是反基因策略，或称反基因技术。,2.三股螺旋DNA（H-DNA）,.,.,当DNA双链中含有H回文序列时，即某区段DNA两条链分别为HPu和HPy，并且各自为回文结构时，任一条回文结构的5和3部分都可以形成分了子内三股螺旋结构及剩余的半条回文结构游离单链。真核生物基因组中存在大量可形成H-DNA的多聚嘌呤核苷酸和多聚嘧啶核苷序列。它们位于：调控区DNA复制起点或终点染色体重组位点，提示它们可能与基因表达调控DNA复制及染色体的重组有关。,.,DNA的三级结构指双螺旋链的扭曲。超螺旋是DNA三级结构的一种形式，DNA在核小体中的扭曲方式也是一种超螺旋结构。超螺旋的生物学意义可能是：1.使DNA分子体积变小，对其在细胞的包装过程有利。2.影响双螺旋的解链过程,从而影响DNA分子与其它分子(如酶、蛋白质、核酸)之间的相互作用。,三、DNA的三级结构,.,线状DNA形成的超螺旋,.,环状DNA形成的超螺旋,.,拓扑异构酶or溴化乙锭,拓扑异构酶or溴化乙锭,DNA扭曲与双螺旋相同（拧紧）,DNA扭曲与双螺旋相反（松开）,负超螺旋,松弛DNA,正超螺旋,在不同类型的拓扑异构酶作用下，DNA的可以在超螺旋和松弛DNA形式之间转变。,.,拓扑异构酶可以催化DNA产生瞬时单链或双链的断裂，从而改变连环数（使环状DNA两条链完全分开时，一条链必须穿过另一条链的次数），使超螺旋DNA解旋。在原核和真核生物中都存在去除超螺旋的拓扑异构酶I和II。,拓扑异构酶（Topoisomerases）,.,拓扑异构酶I:通过一步改变DNA的连环数，不需要ATP。使DNA暂时产生单链缺口，让未被切割的一条单链在切口结合之前穿过这一切口。,.,拓扑异构酶II：通过两步改变DNA的连环数，需要ATP提供能量。在DNA上产生瞬时的双链缺口，并在缺口闭合以前使一小段未被切割的双链DNA穿越这一缺口。,.,DNA的拓扑异构体可以通过电泳分离,长度相同而连环数不同的共价闭合环状DNA分子叫做DNA的拓扑异构体。通过琼脂糖凝胶电泳可以将它们彼此分开。,松弛或有缺口的环状,线状,超螺旋,溴乙锭（EB）可以嵌入核酸分子的碱基对平面之间，在紫外光照射下发出橙黄色的荧光，常作为染料检测核酸的存在。,.,1.信息量大，可以缩微；2.表面互补，电荷互补，双螺旋结构说明了精确复制机理；3.核糖的2脱氧，在水溶液中稳定性好；4.可以突变，以求进化（突变对个体是不幸的，进化对群体是有利的）；5.有T无U，基因组得以增大，而无C脱氨基成U带来的潜在危险。（尿嘧啶DNA糖苷酶可以灵敏识别DNA中的U而随时将其剔除）。,四、DNA作为遗传物质的主要优点,.,五、DNA的变性、复性和分子杂交,1、DNA的变性（denaturation）DNA溶液温度在高于生理温度或者pH较高时，互补的两条链就可以分开，这一过程叫做Denaturation(变性)。DNA变性：紫外吸收增加；DNA的热变性称为DNA的“融解”，50%DNA分子解链的温度称为融点Tm表示；不同种类DNA有不同的Tm值；Tm随（G+C）%含量呈线性增加。,.,.,2、DNA的复性DNA回复成双链结构，称为复性（renaturation）热变性经冷却后即可复性，称为退火(annealing),.,来源不同的两条DNA链经变性后，通过缓慢降温形成的人工杂交的DNA分子的过程。互补的DNA和RNA链也可以形成杂交分子。杂交是分子杂交技术的基础，包括Southern杂交、Northern杂交、DNA芯片等。,3、DNA分子杂交(Hybridization),.,.,Section2核小体,核小体是染色质包装的基本结构单位,一、主要实验证据,.,Isolatedfrominterphasenucleus:30nmthick,Chromatinunpacked,showthenuclesome,（）铺展染色质的电镜观察,.,(2)用非特异性微球菌核酸酶消化染色质,部分酶解片段检测结果,.,由X-射线晶体衍射(2.8A)所揭示的核小体三维结构（引自K.Luger等，1997）,（）应用X射线衍射、中子散射和电镜三维重建技术研究染色质结晶颗粒,.,（）SV40微小染色体分析与电镜观察,.,二、核小体结构要点,(1)每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体及一个分子H1。,(2)组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构。,.,.,(3)146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈,组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bpDNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。包括组蛋白H1和166bpDNA的核小体结构又称染色质小体。(4)两个相邻核小体之间以连接DNA相连，典型长度60bp，不同物种变化值为080bp。,.,(5)组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列，实验表明，核小体具有自组装（self-assemble）的性质。(6)核小体沿DNA的定位受不同因素的影响，进而通过核小体相位改变影响基因表达。,.,核小体的性质及结构要点示意图（引自B.Alberts等）在用微球菌核酸酶降解染色质时，反应早期可得到166bp的片段，但不稳定；进一步降解则得到146bp片段，比较稳定。推测可能原因是失去H1后，DNA两端各有10bp的DNA，易被核酸酶作用而降解。,.,ChromatinPacking,.,ChromatinPacking,.,Section3基因与基因组,基因：表达一种蛋白质或功能RNA的基本单位。基因组：是指某种生物所包含的全套基因。人类基因组的C值在3109bp；病毒含103105bp；细菌含105107bp；,.,基因与蛋白质1000bp(1kb)编码一个蛋白质；病毒含45个基因；大肠杆菌含30004000个基因；人类应有200300万个基因（3109bp)，实际只有10万个左右；病毒的基因数要比计算所得的大，因为有基因重叠现象。,.,结构简练，DNA分子的绝大部分用来编码蛋白质，不转录部分所占比例较小。存在转录单元，功能相关的RNA和蛋白质基因往往形成功能单位或转录单元，一起转录成多顺反子的mRNA。在一些细菌和病毒中有重叠基因，同一段的DNA能携带两种不同蛋白质的编码信息。,原核生物基因组,.,最大的特点是含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA隔开。,真核生物基因组,.,基因组庞大存在大量重复序列基因组序列90%以上的部分是非编码序列转录产物是单顺反子真核基因一般都含有内含子存在大量的顺式元件存在大量的DNA多态性具有端粒结构,真核生物基因组的结构特点：,.,染色质结构及其调控,染色质DNA与蛋白质染色质组装的模型常染色质和异染色质染色质结构与基因活化染色体,.,染色质（chromatin）:在核内可以被碱性染料强烈着色的物质。指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构,是间期细胞遗传物质存在的形式。DNA、组蛋白是染色质的稳定成分。,.,染色体(chromosome):指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中,由染色质聚缩而成的棒状结构。染色质与染色体是在细胞周期不同的功能阶段可以相互转变的的形态结构染色质与染色体具有基本相同的化学组成，但包装程度不同,构象不同。,.,Section1染色质DNA与蛋白质,一、染色质DNA在真核细胞中，每条未复制的染色体包含一条DNA分子，一个生物贮存在单倍染色体组中的总遗传信息，称为该生物的基因组（genome）。基因组大小通常随物种的复杂性而增加。,.,SpeciesGenomesizeSV405103bpE.coli4.6106bpYeast2107bpFruitfly2108bpHuman3109bp,Someamphibianandplantshavelargergenomesizethanhuman.,.,C值与C值矛盾,.,染色质DNA的类型：按序列在基因组中的拷贝数划分：非重复序列（单拷贝序列）：拷贝数15中度重复序列：拷贝数102105高度重复序列：拷贝数105以上,.,按照序列的功能分：蛋白质编码序列可编码的中度重复序列重复序列DNA：不编码的中度重复序列高度重复序列间隔DNA,.,（1）蛋白质编码序列：所占比例随生物复杂程度的不同而异。主要是非重复的单一DNA序列；也有多个拷贝的情况。,.,.,（2）串联重复序列（可编码的中度重复序列）一般的拷贝数是20300个。编码产物包括tRNA，rRNA，snRNA和组蛋白。,TandemlyrepeatedgenesencodeidenticalornearlyidenticalproteinsorfunctionalRNAs.,Thesegenesareneededtomeetthegreatcellulardemandfortheirtranscripts.,.,（3）不编码的中度重复序列DNA：散在重复序列(interspersedrepeats)DNA转座子假基因LTR反转座子非LTR反转座子短散在元件长散在元件,.,（4）高度重复序列DNA简单序列DNA（simplesequenceDNA）卫星DNA（satelliteDNA）：重复单位5100bp,主要分布在着丝粒部位小卫星DNA（minisatelliteDNA）：重复单位12100bp,常用于DNA指纹分析微卫星DNA（microsatelliteDNA）：重复单位15bp,用于遗传图谱构建和个体鉴定,.,二、染色质蛋白,负责DNA分子遗传信息的组织、复制和阅读分类：组蛋白(histone)：与DNA非特异性结合非组蛋白(nonhistone)：与特定的DNA序列或组蛋白结合,.,（一）组蛋白(histone),真核生物染色体的基本结构蛋白，富含带正电荷的Arg和Lys等碱性氨基酸，属碱性蛋白质，可以和酸性的DNA紧密结合（非特异性结合）。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可以区分出5种不同的组蛋白：H1，H2A，H2B，H3，H4。,.,（1）核小体组蛋白(nucleosomalhistone)：H2B、H2A、H3和H4,帮助DNA卷曲形成核小体的稳定结构。没有种属及组织特异性，在进化上十分保守；,组蛋白在功能上分成两组,.,.,（2）H1组蛋白：在构成核小体时，起连接作用,它赋予染色质以极性。有一定的种属及组织特异性，保守性低于核小体组蛋白。,.,（二）非组蛋白,主要指和特异DNA序列结合的蛋白，又称序列特异性DNA结合蛋白(sequencespecificDNAbindingproteins)，可以通过凝胶阻滞实验检测。,.,A非组蛋白的特性非组蛋白具有多样性，不同组织细胞中其种类和数量都不同，代谢周转快。包括核酸代谢和修饰的酶类，骨架蛋白，基因表达的调控蛋白等。识别DNA具有特异性识别信息来自于DNA序列自身，识别位点在DNA双螺旋的大沟部分。具有多种功能，包括基因表达的调控和染色质高级结构的形成。,.,B非组蛋白的结构模式,螺旋-转角-螺旋模式(helix-turn-helixmotif)锌指模式(Zincfingermotif)亮氨酸拉链模式(Leucinezippermotif，ZIP)螺旋-环-螺旋结构模式(helix-loop-helixmotif，HLH)HMG-盒结构模式（HMG-boxmotif）,.,.,Section2、染色质组装的模型,.,1染色质组装的前期过程,组装过程（图519）解决高度压缩结构与转录要求的矛盾：通过染色质修饰酶的作用，使染色质更接近转录机器。包括对组蛋白尾部共价修饰，以及破坏组蛋白DNA接触。,.,2.染色质包装的多级螺旋模型(multiplecoilingmodel),一级结构：核小体(nucleosome)二级结构：螺线管(solenoid)三级结构：超螺线管(supersolenoid)四级结构：染色单体（chromatid）压缩7倍压缩6倍压缩40倍压缩5倍DNA核小体螺线管超螺线管染色单体,.,.,非组蛋白构成的染色体骨架(chromsomalscaffold)和由骨架伸出的无数的DNA侧环30nm的染色线折叠成环,沿染色体纵轴,由中央向四周伸出,构成放射环。,3.染色体的骨架放射环结构模型(scaffoldradialloopstructuremodel),.,EvidenceforScaffoldRadialLoopModel,.,由螺线管形成DNA复制环,每18个复制环呈放射状平面排列,结合在核基质上形成微带(miniband)。微带是染色体高级结构的单位,大约106个微带沿纵轴构建成子染色体。,.,.,.,Section3、常染色质和异染色质,常染色质(euchromatin)异染色质(heterochromatin),.,常染色质(euchromatin),概念：指间期核内染色质纤维折叠压缩程度低,处于伸展状态（典型包装率750倍）,用碱性染料染色时着色浅的那些染色质。主要是单一序列DNA和中度重复序列DNA(如组蛋白基因和tRNA基因)常染色质状态只是基因转录的必要条件而非充分条件。,.,异染色质(heterochromatin),概念：指间期细胞核中,折叠压缩程度高,处于聚缩状态的染色质组分。类型结构异染色质（或组成型异染色质）(constitutiveheterochromatin)兼性异染色质(facultativeheterochromatin),.,结构异染色质的特点,除复制期以外，在整个细胞周期均处于聚缩状态，形成多个染色中心。多定位于着丝粒区、端粒、次缢痕等处；由相对简单、高度重复的DNA序列构成；具有显著的遗传惰性,不转录也不编码蛋白质；,.,与常染色质相比，复制上表现为晚复制早聚缩；在功能上参与染色质高级结构的形成，导致染色质区间性，作为核DNA的转座元件，引起遗传变异。,.,兼性异染色质,在某些细胞类型或一定的发育阶段,原来的常染色质聚缩,并丧失基因转录活性,变为异染色质，如X染色体随机失活.异染色质化可能是关闭基因活性的一种途径。,.,.,常染色质与异染色质之间的转变,常染色质与异染色质之间的转变常常伴随着一些组蛋白和DNA的修饰。,.,对不同Lys位点甲基化产生不同的染色质状态A:代表转录激活R:代表转录抑制,.,四种核心组蛋白的修饰发生在N端。组蛋白修饰的位点:甲基化:Lys和Arg乙酰化:Lys磷酸化:Ser,.,不同组蛋白或同一个组蛋白在不同氨基酸残基上的修饰决定了染色质所处的状态。例如：H3K4、H3K36:该位点甲基化激活基因转录,是活性染色质的标志。H3K9、H3K27、H4K20:该位点甲基化调节染色质结构，是异染色质的标志。,.,.,Section4染色质结构与基因活化,根据功能状态的不同，染色质可以分为：活性染色质（activechromatin）非活性染色质（inactivechromatin）,.,活性染色质是具有转录活性的染色质，这是由于核小体的构型发生构象的变化，往往具有疏松的染色质结构，从而便于转录因子与顺式作用元件的结合、RNA聚合酶在转录模板上的滑动。大多数情况下，转录中染色质的DNA基本保持着同组蛋白的结合，只是随着转录的进行相应的核小体结构出现一系列的变化。,.,（1）活性染色质的结构特点,活性染色质具有DNaseI超敏感位点（DNasehypersensitivesite）活化染色质对DNase的优先敏感性是可转录染色质的一个基本特征。,.,DNaseI超敏感位点是染色质上无核小体的DNA区段，通常位于5-启动子区，长度几百bp。超敏感位点与启动子功能有关，可能为RNA聚合酶、转录因子、蛋白调控因子提供结合位点。,.,活性染色质在生化上具有特殊性,活性染色质很少有组蛋白H1与其结合；活性染色质的组蛋白乙酰化程度高；活性染色质的核小体组蛋白H2B很少被磷酸化；活性染色质中核小体组蛋白H2A在许多物种很少有变异形式；组蛋白H3的变种H3.3只在活跃转录的染色质中出现；HMG14和HMG17只存在于活性染色质中。,.,活性染色质在组蛋白修饰上的特异性,组蛋白的修饰，包括甲基化、乙酰化和磷酸化直接影响染色质的活性。乙酰化一般是活性染色质的标志，而甲基化和磷酸化则在两类染色质中都存在。,.,（2）染色质活化与基因激活,疏松染色质结构的形成是基因活化的前提。,.,核小体相位的影响当调控蛋白与染色质DNA的特定位点结合时，染色质易被引发二级结构的改变，进而影响其它的一些结合位点与调控蛋白的结合。拓扑异构酶可以调整DNA双螺旋的局部构象和高级结构的变化，使其超螺旋化或松弛。,.,核小体通常定位在DNA特殊位点而利于转录,基因的关键调控元件（增强子和启动子）位于核小体颗粒之外，便于和转录因子的结合。基因调控元件位于盘绕核心组蛋白的DNA上，通过转录因子将增强子和启动子联系起来。,.,.,组蛋白的修饰意义：组蛋白的修饰可以改变染色质的结构，影响转录活性。组蛋白修饰使核小体的表面发生改变，使其他的调控蛋白易于和染色质相互接触，间接影响转录活性。,.,染色质的乙酰基化状态是一动态过程，存在乙酰基转移酶（如：转录辅激活子）和去乙酰化酶（如：转录辅阻抑物），分别促进和抑制转录的进行。许多辅激活子（coactivator）具有组蛋白乙酰转移酶功能，自身作为接头蛋白，在基因的上游位点将转录因子和基础转录装置连接起来。,.,辅激活子通过乙酰化调节基因转录的模型,糖皮质激素受体,.,.,转录抑制的模型,.,HMG结构域蛋白的影响可识别某些异型的DNA结构，与DNA弯折和DNA-蛋白质复合体高级结构的形成有关。（染色质变构因子）,.,.,Section5染色体,.,.,一染色体的主要结构,着丝粒（centromere）与着丝点（动粒，kinetochore）次缢痕(secondaryconstriction)核仁组织区(nucleolarorganizingregion,NOR)随体(satellite)端粒(telomere),.,着丝粒与着丝点(动粒),着丝粒区也叫主缢痕，是一个高度有序的整合结构，在结构和组成上非均一，至少包括三个结构域。它们的整合功能，确保分裂中染色体和纺锤体整合，发生有序的染色体分离。,.,（）动粒结构域(kinetochoredomain)在着丝粒的外表面内板(innerplate)中间间隙(middlespace)外板(outerplate)纤维冠(fibrouscorona)：微管蛋白构成,.,.,（）中央结构域(centraldomain)着丝粒区的主体，由串联重复的卫星DNA组成。如：有CENP-B盒可与动粒蛋白结合,.,（）配对结构域(pairingdomain)：代表中期姐妹染色单体相互作用的位点如：内部着丝粒蛋白INCENP(innercentromereprotein)和染色单体连接蛋白clips(chromatidlinkingproteins)和染色体配对有关。,.,.,染色体的复制和稳定遗传，至少应具备以下关键序列（功能元件）:（）确保自我复制的DNA复制起点（）使复制后的染色体能够平均分配到子细胞中去的着丝粒（）保持染色体独立性和稳定性的端粒,二染色体DNA的3种功能