篇谷氨酸发酵.ppt

,第7章谷氨酸发酵,氨基酸的制造是从1820年水解蛋白质开始。1866年德国的立好生博士利用硫酸水解小麦面筋，分离出一种酸性氨基酸，依据原料的取材，便将此氨基酸命名为谷氨酸。随后，日本有一教授在探讨海带汁液的鲜味时，提取了谷氨酸，并在1908年开始制造商品味之素味精。1910年日本味之素公司用水解法生产谷氨酸，与食盐配合出售。但是这种方法生产谷氨酸耗粮太多，成本太高。二次世界大战后不久，美国有人提出用发酵法生产谷氨酸的报告。日本也相继开始了研究，1956年日本协和发酵公司分离出一种新的细菌，它可以利用100克葡萄糖转化为40克以上的谷氨酸。1957年发酵法味精正式商业性生产，这标志着氨基酸发酵工业的诞生。,氨基酸的制备方法,发酵法：发酵法又可分为直接发酵法与添加前体的发酵法。添加前体法是以氨基酸的中间产物为原料，用微生物法转化为相应的氨基酸。提取法：将蛋白质原料用酸水解，然后从水解液中提取氨基酸。目前，胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用提取法生产。酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。合成法：用化学合成法制造的氨基酸有DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸。,生产氨基酸的大国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。,国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。2000年,世界氨基酸产值达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。,一、氨基酸发酵,氨基酸是组成蛋白质的基本成分，其中有8种氨基酸是人体不能合成但又必需的氨基酸，称为必需氨基酸，人体只有通过食物来获得。另外在食品工业中，氨基酸可作为调味料，如谷氨酸钠、肌苷酸钠、鸟苷酸钠可作为鲜味剂，色氨酸和甘氨酸可作为甜味剂，在食品中添加某些氨基酸可提高其营养价值等等。因此氨基酸的生产具有重要的意义。表1列出部分氨基酸生产所用的菌株。,表1部分氨基酸及其生产所用菌株,氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵以谷氨酸为例，谷氨酸的大量积累不是由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及发酵条件的适合。,自从60年代以来，微生物直接用糖类发酵生产谷氨酸获得成功并投入工业化生产。我国成为世界上最大的味精生产大国。味精成为调味品的重要成员之一，氨基酸的研究和生产得到了迅速发展。随着科学技术的进步，对传统的工艺不断地进行改革。如何保持传统工艺生产的特有风味，从而使新工艺生产出的产品更具魅力，是今后研究的课题。,味精的产品特性味精,也称味素,因味精起源于小麦,俗称麸酸钠、谷氨酸钠（分子式C5H8NO4Na）。味精是无色至白色的柱状结晶或白色结晶性粉末,含一分子结晶水，无气味，易溶于水，微溶于乙醇，无吸湿性，对光稳定，中性条件下水溶液加热也不分解，一般情况下无毒性。有很浓的鲜味,味精被食用后,经胃酸作用转化为谷氨酸,被消化吸收构成蛋白质并参与体内其他代谢过程,有较高的营养价值。,味精的使用是否安全？,自从1968年以来，有关谷氨酸的研究报告超过8,000份。自1970年起美国食品药物管理局(FDA)与世界卫生组织(WHO)的联合食品专家委员会，就味精的安全性加以慎重研讨，认为一般人味精摄取量可以达到一天0.12公克/公斤体重。此即表示体重50公斤的人，每天即使食用高达6公克的味精，连续食用一辈子也不会影响到身体的健康。,味精对人体的重要性,1、生物化学的研究显示，味精中的谷氨酸是生物体内氨基酸和碳水化合物代谢的重要桥梁。2、美国Reeds博士的最新研究发现，饮食中的谷氨酸进入消化道时，提供消化道表面细胞代谢所需的大部分能量，也提供其合成必需氨基酸所需的材料。3、Schiffman教授的研究证实，食物中添加味精可以增加正常老人和患病老人的摄食量，也显著地改善营养状况和身体免疫力。,作为调味品的市售味精，为干燥颗粒或粉末，因含一定量的食盐而稍有吸湿性，故应密封防潮贮存。商品味精中的谷氨酸钠含量分别有90、80、70、60等不同规格。以80最为常见，其余为精盐。食盐起助鲜作用兼作填充剂。也有不含盐的颗粒较大的“结晶味精”。,谷氨酸生产,工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。目前世界产谷氨酸钠30万吨/年，占氨基酸总量的2/3。我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。,谷氨酸理论转化率,如果四碳二羧酸(草酰乙酸、苹果酸)全部由CO2固定获得,则1摩尔葡萄糖生成1摩尔的谷氨酸.C6H12O6+NH3+1.5O2C5H9O4+CO2+3H2O理论转化率=147/180=81.7%,谷氨酸产生菌的主要特征,1.-酮戊二酸氧化能力微弱:-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低.2.谷氨酸脱氢酶活性强.3.还原性辅酶(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱.4.异柠檬酸裂解酶活力微弱.5.不利用谷氨酸.6.耐高糖耐高谷氨酸.7.CO2固定能力强.8.解除谷氨酸反馈抑制.9.具有向胞外分泌谷氨酸的能力.,谷氨酸生产菌细胞膜的通透性向胞外分泌谷氨酸,用能积累谷氨酸菌株做如下实验:生物素充足时,细胞内含大量谷氨酸,但培养液里几乎不含谷氨酸用溶菌酶消化细胞壁得到的原生质体仍不分泌谷氨酸当把原生质体放入低渗溶液里,将其涨破,谷氨酸才排出生物素亚适量时,培养液里含大量谷氨酸,细胞里含量少结论:谷氨酸的分泌是由细胞膜控制,控制细胞膜通透性的方法：控制磷脂的合成；控制细胞壁的合成；选育温敏突变株,生物素营养缺陷型,作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏.控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.,突变株,油酸营养缺陷型作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右.控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换.,其他,添加表面活性剂添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸.机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜.关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞.,其他,添加青霉素机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.,其他,谷氨酸发酵强制控制工艺,为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取“强制控制”的方法,如:“高生物素高吐温”或“高生物素高青霉素”的方法.控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量变化的影响,高生物素大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产.,其他,谷氨酸发酵,1,适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h.措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短.2,对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h.措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30-32,谷氨酸发酵,3,菌体生长停止期:谷氨酸合成.措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通气,控制温度34-37.4,发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低.措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐.发酵周期一般为30h.,谷氨酸发酵,谷氨酸除用于制造味精外还可用于治疗神经衰弱及配制营养注射液，应用前景广泛。某醋厂转产用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸，结果代谢产物没有谷氨酸而产生了乳酸及琥珀酸，其原因是：?A温度控制不适BpH呈碱性CpH呈酸性D溶氧不足,二、谷氨酸发酵的生化过程,（1）是代谢控制发酵的典型代表（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的整个过程可简单的分为2个阶段:第1阶段是菌体生长阶段;第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累。,三、合成谷氨酸的生化途径,（一）、GA的生物合成途径,主要有：Glucose的酵解，EMPGlucose的有氧氧化，HMP丙酮酸的有氧氧化，TCA循环乙醛酸循环途径，DCA循环CO2固定反应-KGA的还原氨基化这6条途径之间是相互联系和相互制约的，如图所示：,（二）、GA生物合成的内在因素,从上图可以看出，菌体要在葡萄糖含量10%以上的培养基上，合成5%以上的谷氨酸，是一种不正常的现象，显然GA产生菌必须具备以下条件：,谷氨酸生产菌的生化特征内在因素,1生物素缺陷型谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量(贫乏量),引起菌种代谢失调,使谷氨酸得到大量积累。2具有CO2固定反应的酶系菌种能利用CO2产生大量草酰乙酸,有利于谷氨酸的大量积累。,3.-KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失,这是菌体生成并积累-KGA的关键，从上图可以看出，-KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在-KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由-KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内-KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，-KGA才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。,4.GA产生菌体内的NADPH氧化能力欠缺或丧失,（1）如上图所示，NADPH是-KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联的。（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制-KGA的脱羧氧化有一定的意义。,5.产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶,该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。糖的代谢才能沿着-酮戊二酸的方向进行,从而有利于谷氨酸的积累。,6.菌体有强烈的L-谷氨酸脱氢酶活性,-KGA+NH4+NADPH=GA+NADPL-谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强，-酮戊二酸易生成谷氨酸。该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下：偶联反应-KGANADPH-KGAGANADP异柠檬酸,L-谷氨酸脱氢酶,异柠檬酸脱羧氧化,（三）、GA生物合成的最理想途径,1.在前述GA合成所必需的条件的基础上（，封闭乙醛酸循环）体系不存在CO2固定反应，则有：3/2C6H12O6+NH4+C5H9NO4+4CO2产率：147/（180*3/2）=54.4%,2.在前述GA合成所必需的条件的基础上（，封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有：C6H12O6+NH4+C5H9NO4+CO2产率：147/180=81.7%,可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。,CO2固定反应,(1)磷酸丙酮酸羧化酶的作用下磷酸丙酮酸+CO2+GTP=草酰乙酸+GDP(2)苹果酸酶的作用下丙酮酸+CO2+NADH=苹果酸+NAD需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+,实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA发酵的糖酸转化率应在：54.4%-81.7%。目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内？,（1）企业计算的糖酸转化率是把GA发酵前期菌体增殖时期消耗的葡萄糖计算在内，而我们所计算的不包括这一部分葡萄糖，通常这一部分糖占总量的20%左右，当然与企业的技术水平有关。（2）TCA循环也不可能完全封闭；-KGA也不可能完全转化为GA；生成的GA也不可能完全分泌的细胞外；发酵液中还存在一定的残糖，通常在0.5%-0.7%之间。,提高GA的潜力,（1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn+，生物素？（2）控制溶氧浓度是非常重要的低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化高的溶氧浓度，则NADPH有被氧化的可能，,（四）、生物素对GA发酵的影响,GA产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH-生物素对发酵的影响是全面的，在发酵过程中要严格控制其浓度。,1.生物素对糖代谢的影响,VH对于糖酵解有促进作用;对丙酮酸的有氧氧化乙酰辅酶A的生成也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸生成，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。,1.生物素对糖代谢的影响,另一方面，可以通过控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。封闭乙醛酸循环对于GA发酵的重要性,如何封闭乙醛酸循环呢？,DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响：为醋酸诱导受琥珀酸阻遏，其活性受琥珀酸的抑制？（受到Glucose的阻遏）,如何封闭乙醛酸循环呢？,当VH缺乏时：（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于VH对TCA循环的促进作用)，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。,2.生物素对氮代谢的影响,由以上分析可知，当VH缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱。当VH丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则DCA循环正常进行，DCA循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能和水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则GA的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。,以上分析说明，GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。,3.VH对菌体细胞膜通透性的影响,3.VH对菌体细胞膜通透性的影响,菌体进入产物合成期时，有GA的产生，如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA对L-谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而使由GlucoseGA的高效率转化，反之，如果。可见，改善细胞膜通透性的重要性如何进行呢？,谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性的调节。VH对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径如下：,其中，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是VH，VH在此反应过程中起到传递CO2的作用。当培养基中VH的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。,（五）GA发酵的外在因素,GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的菌体特性，诸如：？（提问），但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。,1.供氧浓度,过量：NADPH的再氧化能力会加强，使-KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。,2.NH4+浓度,（1）影响到发酵液的pH值（2）与产物的形成有关：NH4+过量，菌体增殖阶段会抑制菌体生长，产酸阶段Glu会受谷氨酰胺合成酶作用转化为GlnNH4+不足，不利于-KGA的还原氨基化，-酮戊二酸积累，引起反馈调节,NH4+与产物的形成,NH4+的供给方式：（1）液氨（2）流加0.8%尿素,3.磷酸盐,过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等（2）产生并积累Val，,发酵过程中,要严格控制NH4+和P的含量,环境条件,4.发酵液的碳氮比发酵液中糖含量与谷氨酸的发酵有密切的关系。在一定范围内,谷氨酸的产量随糖含量的增加而增加,但糖含量过高,渗透压过大,对菌体生长不利,谷氨酸对糖的转化率低。发酵液中还原糖的含量一般应控制在10%13%,环境条件,氮源是合成菌体细胞蛋白质、核酸和谷氨酸的氨基来源，大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌体。谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多，一般发酵工业碳氮比为100：0.22.0，谷氨酸发酵的碳氮比为100：1521。在谷氨酸发酵过程中,应正确控制碳氮比。一般在菌体生长期碳氮比应大一些(氮低）,在产酸期,碳氮比应小些(氮高）。在碳源和氮源的比为31时，谷氨酸棒状杆菌会大量合成谷氨酸，但当碳源和氮源的比为41时，谷氨酸棒状杆菌只生长而不合成谷氨酸？。,环境条件,5.生物素谷氨酸产生菌是营养缺陷型,对生长繁殖、代谢产物的影响非常明显。当生物素过量时酵解途径中的丙酮酸转变为乳酸,同时也使异柠檬酸转变为琥珀酸,菌体生长繁殖快,同时生物素又促进菌体细胞膜通透性障碍物的生物合成,使菌体不能及时将细胞内的谷氨酸排出,谷氨酸合成途径受阻,发酵液中由菌种细胞排出的谷氨酸仅能占氨基酸总量的12%;生物素亚适量时,菌体代谢失调,细胞膜通透性增强,细胞内的谷氨酸能及时排出,有利于谷氨酸的积累,发酵液内由菌体细胞排除谷氨酸能达总氨基酸的92%左右。因此,要根据发酵时期来控制生物素的含量。,环境条件,6.发酵温度谷氨酸发酵前期应采取菌体生长最适温度,即3032。温度过低,菌体生长繁殖慢;若温度过高,菌体易衰老,生产中表现为DO值增长慢,耗糖慢,pH值高,最终发酵周期长,产酸少。发酵中、后期菌体生长基本停止,为积累大量谷氨酸,应适当提高发酵温度,但温度过高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。,环境条件,7.pH值1）pH值对谷氨酸产生菌生长的影响谷氨酸产生菌象其它微生物一样,有最适生长pH值范围,当高于或低于这个值时:(1)菌体内的酶受到抑制,菌体新陈代谢受阻,生长停滞;(2)菌体细胞膜所带电荷发生改变,从而改变细胞膜的渗透性,影响菌体对营养的吸收和代谢产物的排出;(3)影响培养基组分和中间代谢产物的离解,从而影响菌体对这些物质的利用。,环境条件,2）pH值对谷氨酸积累的影响谷氨酸脱氢酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最适pH为7.07.2,当发酵液的pH值偏酸时(pH5.0-5.8),谷氨酸脱氢酶受到抑制,代谢向着生成谷氨酰胺和乙酰谷氨酰胺的方向进行。在发酵后期由于耗用大量NH4+,pH值下降,此时就要进行pH值调节,以保证发酵的正常进行。,环境条件,pH发生变化的主要原因是培养基中营养成分的利用和代谢产物的积累。如当谷氨酸棒状杆菌利用糖类物质不断生成谷氨酸时，培养液的pH就会下降。而碱性物质的消耗和氨的生成等则会导致培养液的pH上升。pH：前期pH（7.58.0），中后期pH7.07.6。通过采用流加尿素，氨水或液氨等办法调节pH，补充氮源。,环境条件,8.通风（同1.供氧浓度）通风的实质就是供氧并使菌体和培养基充分混合。谷氨酸产生菌为兼性好氧菌,在有氧、无氧的条件下都能生长,只是其代谢产物不同。在谷氨酸发酵过程中,通风必须适度。风量过大,氧气充足,在长菌阶段表现为耗糖慢,菌体生长慢,pH值偏高,产酸阶段,供氢体被氧化,谷氨酸合成受阻,积累-酮戊二酸;风量小,供氧不足,长菌阶段表现为菌体生长快,在产酸阶段,葡萄糖进入菌体后,进行不完全氧化,产物由谷氨酸变为乳酸。,环境条件,9.泡沫谷氨酸发酵是好气性发酵,因通风和搅拌产生泡沫是正常的,但泡沫过多会带来一系列问题:(1)泡沫形成泡盖时,代谢产生的气体不能及时排出,妨碍菌体呼吸作用,影响菌体的正常代谢;(2)泡沫过多,发酵液会外溢,造成浪费和污染;(3)泡沫过多,易冲上罐顶,造成染菌。因此,在谷氨酸的发酵过程中控制好过多的泡沫是发酵成败的关键。,谷氨酸产生菌的发酵条件与产物的关系,谷氨酸发酵过程中,生产菌种的特性、生长素、发酵温度、pH值、通风和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要因素。在实际生产中,只有针对存在的问题,严格控制工艺条件,才能达到稳产、高产的目的。,假设人们想利用葡萄糖、谷氨酸棒状杆菌生产-酮戊二酸，请你利用现有知识，设计一个大量积累-酮戊二酸的方案?菌种：对谷氨酸捧状杆菌进行诱变处理，选育不能合成谷氨酸脱氢酶的菌种条件：氧（通风）、NH4+、C/N；pH、磷酸盐、温度、生物素、Mn+,代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用,工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。人工控制代谢的手段：改变微生物遗传特性(遗传学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）；改变细胞膜透性；,总结,1营养缺陷型菌株的应用,末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物C。,(一)遗传学方法,(2)分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷型克服协同、或累加抗反馈抑制，积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中间产物,分支途径赖氨酸发酵:谷氨酸棒杆菌的Hom,2抗反馈控制突变株的应用,抗反馈控制突变株是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性突变株和营养缺陷性回复突变株中获得。,3选育组成型突变株和超产突变株,如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变株称为组成型突变株。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。,（二）生物化学方法,1.添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生,2.添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底物的衍生物，3.发酵与分离过程耦合：4.控制发酵的培养基成分：,（三）控制细胞膜渗透性,使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。1.用生理学手段直接抑制膜的合成或使膜受缺损如:在Glu发酵中把生物素浓度控制在亚适量可大量分泌Glu；控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；,（三）控制细胞膜渗透性,2.利用膜缺损突变株油酸缺陷型、甘油缺陷型如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，适量添加青霉素也可以获得大量谷氨酸。,四、谷氨酸发酵1）谷氨酸生产菌,谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌。我国使用的生产菌株是北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌AS1.542、棒杆菌S-914和黄色短杆菌T613等。,谷氨酸棒杆菌,生产菌株特点,在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有一些共同特点:革兰氏阳性菌体为球形、短杆至棒状不形成芽孢没有鞭毛，不能运动需要生物素作为生长因子在通气条件下才能产生谷氨酸。,2）生产原料,发酵生产谷氨酸的原料有淀粉质原料：玉米、小麦、甘薯、大米等。其中甘薯和淀粉最为常用；大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化，8530min，加糖化酶60糖化24h，过滤后可供配制培养基。糖蜜原料：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜；糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中青霉素。氮源料：尿素或氨水。,3）工艺流程,味精生产全过程可分五个部分：原料的预处理及淀粉水解糖的制取；谷氨酸生产菌种子的扩大培养；谷氨酸发酵；谷氨酸的提取与分离；由谷氨酸制成味精及味精成品加工。,味精生产的主要原材料为淀粉辅助材料包括硫酸、液氨、碳酸钠、活性碳、液碱、盐、消泡剂、淀粉酶等,年产12万吨味精，主要原辅材料耗用如下表：项目单位：吨淀粉196,870液氨31,108硫酸35,000碳酸钠30,000活性碳2,500液碱40,000盐8,000消泡剂77,960淀粉酶11,694,4）发酵生产工艺培养基成分,碳源：碳源是构成菌体和合成谷氨酸的碳架及能量的来源。谷氨酸产生菌是异养微生物，只能从有机物中获得碳素，细胞进行合成反应所需要能量也是从氧化分解有机物过程中得到的。实际生产中以糖质原料为主。培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有密切的关系。在一定的范围内，谷氨酸产量随糖浓度的增加而增加。,氮源：氮源是合成菌体蛋白质、核酸及谷氨酸的原料。碳氮比对谷氨酸发酵有很大影响。大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌体。谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多，一般发酵工业碳氮比为100：0.22.0，谷氨酸发酵的碳氮比为100：1521。,无机盐：是微生物维持生命活动不可缺少的物质。主要功能：构成细胞的组成成分；作为酶的组成成分；激活或抑制酶的活力；调节培养基的渗透压；调节培养基的pH；调节培养基的氧化还原电位。起着调节微生物生命活动的作用。发酵时，使用的无机离子有K+、Mg2+、Fe2+、Mn2+等阳离子和PO43-、SO42-、Cl等阴离子，其用量如下：,KH2PO40.05%0.2%K2HPO40.05%0.2%MgSO4.7H2O0.005%0.1%FeSO4.7H2O0.0005%0.01%MnSO4.4H2O0.0005%0.005%,生物素：凡是微生物生命活动不可缺少，而微生物自身又不能合成的微量有机物质都称为生长因子。生长因子通常是指氨基酸、嘌呤、嘧啶和B族维生素的一种，生物素又叫维生素H或辅酶R。糖质为碳源的谷氨酸产生菌几乎都是生物素缺陷型，这些细菌本身都不能合成生物素。生物素的作用是影响代谢途径；影响细胞的渗透性。生长因子含量的多少，与生产有着十分密切的关系。实际生产中通过添加玉米浆、麸皮水解液、糖蜜等作为生长因子的来源，来满足谷氨酸产生菌必须的生长因子。,培养基a斜面培养基,葡萄糖0.1%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%、琼脂2.0%、pH7.07.2121灭菌30min32培养18-24h(传代和保藏斜面不加葡萄糖)。,b一级种子、二级种子及发酵培养基,一级种子葡萄糖2.5%、尿素0.6%、KH2PO40.1%、MgSO4.7H2O0.04%、玉米浆2.33.0ml、pH7.0,1000ml装200-250ml振荡，32培养12h。二级种子水解糖3.0%、尿素0.6%、玉米浆0.50.6ml、K2HPO40.10.2%、MgSO4.7H2O0.04%、pH7.0,呈单个或八字排列。活菌数为108-109/ml。发酵培养基水解糖1214%、尿素0.50.8%、玉米浆0.6ml、MgSO4.7H2O0.06%、KCl0.05%、Na2HPO40.17%、pH7.0,发酵条件的控制a温度,谷氨酸发酵前期(012h)是菌体大量繁殖阶段，在此阶段菌体利用培养基中的营养物质来合成核酸、蛋白质等，供菌体繁殖用，而控制这些合成反应的最适温度均在3032。对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。12h。措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30-32在发酵中、后期，是谷氨酸大量积累的阶段，而催化谷氨酸合成的谷氨酸脱氢酶的最适温度在3236，故发酵中、后期适当提高罐温对积累谷氨酸有利。,bpH值,发酵液的pH影响微生物的生长和代谢途径。发酵前期如果pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌而不产酸；如果pH偏高，则菌体生长缓慢，发酵时间拉长。在发酵前期将pH值控制在7.58.0左右较为合适，而在发酵中、后期将pH值控制在7.07.6左右对提高谷氨酸产量有利。,c通风,在谷氨酸发酵过程中，发酵前期以低通风量为宜；发酵中、后期以高通风量为宜。实际生产上，以气体转子流量计来检查通气量，即以每分钟单位体积的通气量表示通风强度。另外发酵罐大小不同，所需搅拌转速与通风量也不同。,d泡沫的控制,在发酵过程中由于强烈的通风和菌体代谢产生的CO2，使培养液产生大量的泡沫，不仅使氧在发酵液中的扩散受阻，影响菌体的呼吸和代谢。给发酵带来危害，必须加以消泡。消泡方法有机械消泡(耙式、离心式、刮板式、蝶式消泡器)和化学消泡(天然油脂、聚酯类、醇类、硅酮等化学消泡剂)两种方法。,e发酵时间,不同的谷氨酸产生菌对糖的浓度要求也不一样，其发酵时间也有所差异。低糖(10%12%)发酵，其发酵时间为3638h，中糖(14%)发酵，其发酵时间为45h。,谷氨酸发酵例子,某谷氨酸发酵，发酵过程中各种参数的变化情况如图所示。最后的发酵液中谷氨酸的浓度很低，发酵周期较长，而这段时间却有大量的葡萄糖被消耗，那么，这些被消耗的葡萄糖到哪里去了？,出现这种情况的原因是由于发酵过程中感染了杂菌，造成了大量的葡萄糖被消耗，但是并没有产生谷氨酸,发酵过程中发酵液的pH值控制的不合适或者是发酵液NH4浓度过高，使得产生的谷氨酸转变成谷氨酰胺?,显然，发酵过程中出现了异常情况，找出真正的原因。须根据发酵过程中其他参数如溶氧浓度的变化，结合菌体形态观察等进一步分析，是由于发酵用培养基中添加的玉米浆过量，导致生物素浓度过高，这样菌体不能顺利地实现从生长型到产物积累型的转变，因而出现了这种在工业生产上称之为“只长菌，不产酸”的发酵异常现象。,五、谷氨酸提取工艺等电点法提取操作简单，收率60。周期长，占地面积大,等电点法提取谷氨酸原理谷氨酸：-型斜方晶体（好），-型(轻麸酸)鳞片状晶体；型结晶水分在510%,而型结晶水分则高达1520%。生产上应防止型晶体的生成。注意三个方面A、发酵液纯度高：谷氨酸/残糖比值高，胶体少，提前除菌体最好；B、发酵液处理要及时；C、加酸调pH、温度、育晶时间、搅拌服从结晶规律。,等电点法提取谷氨酸原理,谷氨酸在等电点时,绝大部分以偶极离子(GA)状态存在,其分子内部正负电荷相等,并含有等量的带不同电荷的阳离子(GA+)和阴离子(GA-),因此溶液中总静电荷等于零。由于谷氨酸分子之间相互碰撞,再通过静电引力的作用,结合成较大的聚合体而被沉淀析出,因而处于等电点时GA的溶解度最小。又由于温度对GA的溶解度影响很大,温度越低溶解度越小,生产上多采用04。这就是工业粗提味精所用的等电点法提取谷氨酸原理,等电点法提取谷氨酸原理,等电点时谷氨酸四种离子方式在水溶液中所占的比例GA+:7.861%,GA:84.24%,GA-:7.861%,GA=:0.278910-5%,离子交换法提取GA的原理,离子交换法提取GA的原理当氨基酸pH值大于3.22时羧基离解而带负电,它能被阴离子交换树脂吸附;当pH小于3.22时氨基离解而带正电,此时能被阳离子交换树脂吸附。离子交换法提取GA是利用阳离子交换树脂对GA阳离子的选择性吸附,以使发酵液中阻碍GA结晶的残糖及糖的聚合物、蛋白质、色素等非离子性杂质得以分离,然后经洗脱达到浓缩提取GA的目的。,离子交换法提取,离子交换法提取,发酵液稀释并调pH5.05.5?上柱732#阳离子(H型)交换70水洗*（正或反洗）604%NaOH液正洗脱高流分收集调pH3.2结晶离心分离谷氨酸树脂：苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂732#、730#和甲基丙烯酸弱酸型阳离子交换树脂。树脂处理：柱水洗（正和反洗）5.4%HCl再生水洗水洗*:洗脱粘附于树脂表面的菌体、胶体,并疏松树脂料液中不仅有GA，还有NH4+和其他金属离子;阳离子交换树脂对NH4+和其他金属离子的亲和力大于对谷氨酸的亲和力。上柱时NH4+和其他金属离子先发生交换，把H+置换下来，液体pH降低，使主要以GA+形式存在，随后GA+发生交换。,水洗*目的:温柱，防止GA在柱中结晶析出产生“结柱”预热树脂，避免热碱液聚热发生破碎采用NaOH洗脱剂洗脱时,由于谷氨酸在树脂内部较为集中,NaOH浓度不能太高,温度又不能太低。一般以4%的浓度,6070的温度洗脱较好,否则将产生“结柱”。离子交换收集液的低（初）流分可以上柱再交换；高流分收集调pH3.2结晶；后流分单独上离子交换柱进行回收。