DNA体外重组与转化宿主细胞及其筛选与检测.ppt

一、农业上有利用价值的基因及其应用(一)抗植物虫害基因及其应用全球每年农作物因虫害造成的损失占总产量的13%，而目前对虫害的防治主要依赖于农药，长期施用农药不仅造成了严重的环境污染，而且给人类自身的健康也造成了严重危害。,抗虫基因的类型：抗植物虫害的基因有几十种，根据其来源分三类：bt基因：从苏云金杆菌分离出的杀虫结晶蛋白基因昆虫蛋白酶抑制剂基因：其中应用最多的是红豆胰蛋白酶抑制剂基因（cpti）植物凝集素基因（lectingene）,1、bt基因及其应用苏云金杆菌为革兰氏阴性菌，在芽胞形成过程中，可产生伴孢晶体，伴孢晶体由一种或多种蛋白组成，具有高度特异性杀虫活性，这种蛋白称为-内毒素或杀虫结晶蛋白（ICP）。Bt基因编码的内毒素为130160KD的多肽。,最早转bt基因获得成功是在1987年，当年世界上有4个研究小组获得了转bt基因的烟草和番茄。目前，bt基因已被转到多种作物中，如水稻、棉花、玉米、番茄、马铃薯-等。,Bt毒蛋白的类型：杀虫晶体蛋白（insecticidalcrystalprotein，ICP）营养期杀虫蛋白（vegetativeinsecticidalprotein，VIP）,根据ICP的抗虫谱及它们的序列同源性，ICP分为四个主要类型：I型（CryI）：具有抗鳞翅目昆虫的活性，对其幼虫有特异的毒性作用。II型（CryII）：抗鳞翅目和双翅目昆虫III型（CryIII）：抗鞘翅目昆虫IV型（CryIV）：抗双翅目昆虫至今已有近180个不同的Bt杀虫晶体蛋白基因被克隆和测序。,转基因抗虫棉的研制过程,Bt毒蛋白杀虫的原理原毒素（晶体蛋白）蛋白酶pH10-125570KD的小肽昆虫肠道上皮纹缘细胞膜上特定的受体蛋白结合使细胞膜结构破坏，细胞渗透平衡失调，使肠道穿孔，昆虫停止进食，最终死亡,研究表明，未经改造的bt基因在转基因植物中的表达水平很低，只占植株内全部可溶性蛋白的0.001%以下，不能直接毒杀害虫，因此，必需对原核bt基因进行修饰改造，以提高其表达活性和表达量。,我国2009年底为转基因抗虫水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”发放了安全证书，由华中农业大学培育的高抗鳞翅目害虫转基因水稻品系。,2、蛋白酶抑制剂基因及其应用植物中含有蛋白酶抑制剂（proteinaseinhibitor,PI）,在多数植物的种子和块茎中，其含量可达总蛋白的1%-10%，某些果实中丝氨酸蛋白酶抑制剂的含量可达总蛋白的30%。蛋白酶抑制剂在植物防御昆虫和病原体侵染的中起重要作用。使用某些纯化的蛋白酶抑制剂喂养昆虫发现，其具有明显的抗虫作用。,抗虫原理：PI与昆虫消化道内的蛋白酶结合PI&E复合物使蛋白酶不能水解外源蛋白质；EI复合物刺激昆虫分泌过量的消化酶使昆虫产生厌食反应，缺乏生活所需要的氨基酸，最终使昆虫发育不正常或死亡。,蛋白酶抑制剂的类型：丝氨酸蛋白酶抑制剂巯基蛋白酶抑制剂金属蛋白酶抑制剂其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂与抗虫关系最密切，因大多数昆虫所利用的蛋白消化酶是丝氨酸类蛋白酶。,丝氨酸类蛋白酶抑制剂有6个家族，其中虹豆蛋白酶抑制剂（CPTI）和马铃薯蛋白酶抑制剂II（Pi-II）的抗虫效果最好。,蛋白酶抑制剂基因的应用：目前已有多种蛋白酶抑制剂的基因或cDNA被克隆，其中有些表现出具有明显的抗虫作用。最早在1987年，英国的研究者Hilder等把编码cpti的cDNA转化到烟草中，首先获得转cpti基因的烟草植株，有些转基因植株中cpti的表达量高达9.6g/mg可溶性蛋白。,CPTI表达量与抗虫力呈正相关：CPTI的表达量达到5g/mg可溶性蛋白时，转基因植株就表现出明显的抗虫性。转基因植株具有抗烟草蚜蛾、玉米穗蛾、棉铃虫和粘虫作用，其中接种的烟草蚜娥死亡率为50%-62.5%。cpti基因被转到各种重要作物中，如水稻、油茶、苹果、杨树等。,3、植物凝集素基因及其应用植物凝集素（lectin）是非免疫来源的糖蛋白或结合糖的蛋白质，是寡聚蛋白，二聚体或四聚体。广泛存在于植物中，在各种组织器官中均有发现，尤其是豆科植物种子中含量最丰富；在细胞中主要存于蛋白粒中。,凝集素的特性：能和糖蛋白结合，使糖蛋白沉淀或聚集细胞。抗虫原理：当被昆虫取食后，外源凝集素在昆虫的消化道中与上皮细胞的糖蛋白受体结合，从而影响养分的吸收。这种结合具有专一性，即不同的外源凝集素与相应的糖类结合。此外，外源凝集素可能在昆虫的消化道内诱发病灶，促进消化道中的细菌繁殖，对昆虫造成危害而达到杀虫目的。,凝集素的类型：豌豆凝集素麦胚凝集素雪花莲凝集素英国的研究者把雪花莲凝集素基因成功的导入到烟草和莴苣中，转基因烟草对蚜虫表现出明显的抗性。,（二）抗植物病毒基因及其应用病毒引起的作物病害十分严重，全球每年农作物的损失达200亿美元，有些作物少的损失10-20%，多的达80%，甚至颗粒无收。我们在对付病毒病方面没有有效的对策，常规的杂交育种也很难培育出高抗性的品种，而基因工程技术为培育抗病毒病新品种开辟了新途径。,抗病毒基因工程的技术路线：导入病毒外壳蛋白基因利用植物本身编码的抗病毒基因利用反义RNA技术利用RNAi技术,1、病毒外壳蛋白基因（coatprotein，CP）及其应用CP基因的抗病毒原理：CP基因导入植物细胞后，可能以下述作用方式使植物细胞获得保护作用：一种假说认为，当入侵病毒的裸露核酸进入植物细胞后，立即被细胞中的自由CP重新包装，从而阻止了入侵病毒核酸的复制和翻译。,病毒入侵宿主细胞及其繁殖过程,在离体条件下，实验表明附加的自由CP能够抑制未装配病毒翻译的结果支持了上述假说。另一假说认为，抗性机制是在CP水平上抑制病毒脱壳，此说法最有力的证据是转基因植株可抗完整病毒的侵染，但不能抵抗裸露病毒RNA的入侵。,中国科学院微生物所的科研人员率先将病毒的CP基因转入植物，获得了能够稳定遗传的抗病毒烟草、马铃薯、线辣椒、大豆、番木瓜、西瓜等一批转基因植物。其中同时表达TMVCP基因和黄瓜花叶病毒CP基因的转基因烟草对TMV和黄瓜花叶病毒表现很高的抗性，而且外源基因能够稳定遗传，并于1993年荣获中国科学院科技进步一等奖。,转cp基因抗病植株,转马铃薯Y病毒CP基因的马铃薯,转基因植株的田间试验显示，凡是表达病毒cp的植株都有一定的抗病性，表现为很少失绿或有坏死病斑，侵染病毒的扩展被阻止、推迟或减轻等，不影响植株的生长发育。抗病性的强弱与整合到植物细胞中的cp拷贝数有关，含多拷贝的植株比单一拷贝植株抗性强。,目前已有多种病毒的cp被克隆，如：烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯X病毒、y病毒，黄瓜花叶病毒（CMV）、水稻条纹叶枯病毒（RSV）、苜菽花叶病（ALMV）-等。cp已被转移到烟草、马铃薯、番茄、欧洲李、杏和水稻-等作物中。,2、反义RNA介导抗病毒：从技术上，反义RNA策略是将病毒基因反向连接在真核启动子后导入植物中，植物细胞中表达的反义RNA与病毒有义RNA互补，从而抑制病毒mRNA的翻译。DNA模板链转录mRNA编码链反义RNA,AB,CD,vir,反义,反义RNA：指在真核和原核生物中，跟一般转录所得的mRNA互补的RNA分子称之。当反义RNA与有义RNA形成双链分子时阻止了翻译进行，导致基因产物合成量减少，同时双链的RNA分子容易降解，使特定的mRNA数量减少。,已有研究者对TMV、CMV、PVX、TEV等病毒构建了反义RNA基因，转化马铃薯、烟草等，转基因植株有一定的抗病性，但抗病性低于CP介导的抗性。,（三）耐除草剂基因及其应用采用除草剂控制杂草已成为现代农业不可缺少的部分。除草剂的使用可以减少劳动力和成本的投入，但除草的同时也会把作物杀死。目前，通过基因工程的手段培育耐除草剂的作物品种已成为可能和现实。,培育耐除草剂品种的策略有两种：一是修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感，或促使其过量表达使植物吸收除草剂后仍能进行正常代谢；二是引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解而解毒。采用这2种策略都有成功的报道。,1、草甘膦的除草机理及EPSPS基因草甘膦的特性：内吸传导型、非选择性的有机磷除草剂，对一年生和多年生杂草均有很强的控制能力，在土壤中容易被微生物降解，对动物无毒害。,草甘膦的除草机理：草甘膦特异性的抑制植物和细菌中的莽草酸羟基乙烯转移酶（EPSPS）的活性，而EPSPS是莽草酸途径中的一个必需合成酶。PEP+S3PEPSP芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）S3P：莽草酸-3-磷酸；EPSP：5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸,EPSPS,草甘膦的分子结构与PEP相似，可作为竞争性抑制剂，与EPSPs、S3P形成复合物，阻遏PEP和EPSPs的结合，从而阻断芳香族氨基酸的合成，使得植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸以及蛋白质等代谢过程受到影响而死亡。,草甘膦分子结构,采用转基因技术提高EPSPS的表达量获得草甘膦抗性植株。1990s中期抗草甘膦作物开发成功，随后抗草甘膦基因被转移到各种作物上，目前已经研制成功并逐步推广的抗草甘膦作物有大豆、油菜、棉花、玉米、水稻、甜菜、花生、烟草、马铃薯、春小麦、向日葵、番茄、胡萝卜、洋葱、菠菜、南瓜、番木瓜、苜蓿、百脉根、黑麦草、葡萄及橡树等20多种植物。大面积推广种植的有抗除草剂大豆、玉米、棉花等。,抗除草剂和非抗除草剂大豆,转基因抗除草剂小麦与普通小麦(control)在喷施除草剂前(A)后(B)的表现,2、草丁膦的除草机理及bar基因草丁磷的作用特性：有机磷除草剂，是非选择性除草剂Basta的活性成分。D-草丁膦：无除草剂活性L-草丁膦：有除草活性L-草丁膦强烈抑制谷胱甘肽合成酶（GS）的活性而起除草作用。在植物中GS的作用是解除在氨基酸降解过程中产生的氨的毒性。,乙酰辅酶A+L-草丁膦乙酰-L-草丁膦从链霉菌分离出的编码乙酰辅酶A转移酶的基因称为bar基因，将bar基因导入烟草、马铃薯、番茄中，获得了抗Basta的转基因植株。其中转基因烟草能耐受除草剂的量是田间用量的4-10倍。研究发现，只要bar基因在叶中的表达量达到叶蛋白总量的0.0001%的水平，转基因植株便能耐受草丁磷的处理。,乙酰辅酶A转移酶,(四)渗透调节物质合成酶基因及其应用氨基酸及其衍生物：脯氨酸、甘氨酸甜菜碱等；糖类：海藻糖、果聚糖等；多元醇：甘露醇、山梨醇等，其中海藻糖和甜菜碱为次生代谢产物。,渗透调节物质,作用：在高盐或干旱条件下，能维持植物细胞的渗透平衡和水分平衡、消除逆境胁迫造成的伤害。如海藻糖和甜菜碱广泛存在于植物、动物和微生物中，当细胞处于高温、脱水和低温逆境下胞内海藻糖含量迅速升高，可以非特异性的稳定蛋白质、核酸等生物大分子的结构，起保护剂的作用。,1、脯氨酸合成酶基因植物中脯氨酸合成酶（P5cs）基因对非生物胁迫下脯氨酸的合成起主要作用。1995年Kishor等人从乌头叶虹豆中克隆P5cs基因，转入烟草，转基因烟草的脯氨酸含量比对照高10-18倍。在干旱胁迫下，对照烟草中的脯氨酸含量由0.08mg/g鲜叶重增加到3mg/g；转基因植株脯氨酸含量由1mg/g增加到6.5mg/g。,转基因植株的形态表现：干旱胁迫下，落叶少而且比较迟，生物量比对照增加2倍。,2、海藻糖合成酶基因海藻糖广泛分布于细菌、藻类、酵母、低等植物、昆虫和其他无脊椎动物中,尤其是在霉菌、蘑菇等真菌中含量可高达干重的20%左右。海藻糖的特点和作用：非还原性二糖；在正常条件下,为生物体的代谢活动贮存和提供能量,在逆境条件下起保护生物大分子和生物膜结构的作用。,海藻糖的合成过程途径一,途径二：以淀粉为底物的海藻糖合成途径，1993年在一种嗜超高温古细菌硫矿硫化叶菌(SulfolobussolfataricusMTSase)中发现的,美国研究人员成功的把该海藻糖合成酶基因转入水稻中，转基因水稻能够更有效抵御干旱、多盐和寒冷这三大恶劣环境。光合效率比一般水稻高出15左右，对土壤中锌和铁等微量营养元素的利用能力也相对更强。并且该基因只在水稻的根叶表达海藻糖，而在谷粒中不表达。,荷兰植物生物技术公司将编码大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸酯酶的编码基因otsA和otsB基因克隆，构建成一个操纵子otsBA，将其导入甜菜、马铃薯中，增加了甜菜和马铃薯中海藻糖的含量，同时增强了转基因植株的抗旱性和抗寒性。,3、甜菜碱合成相关基因CMO：胆碱单加氧酶CDH：胆碱脱氢酶BADH：甜菜碱醛脱氢酶COD：胆碱氧化酶,在0%、0.3%、0.6%NaCl胁迫下，转BADH基因马铃薯的生长状况,非转基因植株,转基因植株,液体培养法诱导的马铃薯Favorita的试管薯,（五）提高作物产量的基因及其应用1、植物光合作用机制,C3和C4植物固定CO2的差别和产量差异C3C4C同化的酶RubisiscoPEPCase及其特点RUBP+CO23-PG对CO2的亲和力RUBP+O2磷酸乙醇酸强，能固定低（光呼吸）浓度的CO2光合效率较低较高作物产量较低较高,2、提高作物产量的设想和策略（1）向C3植物导入C4植物中的PEPCase基因，提高其固定CO2的能力。（2）提高Rubisisco的羧化活性。,3、作物改良的试验研究概况1988年Tagu等将高粱的PEPCase的cDNA导入矮牵牛的原生质体中，并成功的诱导出愈伤组织和分化出再生植株。焦德茂等2004年报道，成功地将玉米的pepc导入水稻，获得4个具有高光效特性的水稻新株系，其中一个小面积产量比对照提高了20左右。,对于提高Rubisisco的羧化活性的研究：该途径难度比较大，因为Rubisisco是560kDa的蛋白质复合体，由8个大亚基和8个小亚基组成。在Rubisisco基因工程中，不仅要考虑大、小亚基的装配问题，还要考虑构建基因对酶复合体的影响。,（六）控制果实成熟期的基因及其应用1、调控果实成熟的意义：番茄、香蕉、苹果、葡萄、草莓、菠萝、荔枝、龙眼等在贮藏和运输过程中，由于成熟过程迅速，很难控制，常导致过熟、腐烂，或货架期较短，影响销售，造成巨大经济损失。,2、控制果实成熟、延长保鲜期的方法常规做法：降低温度、增加CO2等控制呼吸作用以延缓成熟。但是存在阻止成熟的效果不太令人满意、成本高、储存规模不大的缺点。3、果实成熟与呼吸跃变及乙烯的关系内源乙烯生成超过某阀值是果实发生跃变的前提，该值约为0.1-1.0mg/kg。,跃变型果实在成熟时发生一系列成分的急速变化：多糖水解、细胞壁结构物质如果胶的水解、有机酸变化、香气增加、乙烯生成量升高、涩味消失、色泽发生变化等。此外，由于果实组织、硬度下降，容易感染病害。,充分成熟的香蕉更香甜,香蕉黑星病,植物体内乙烯生物合成的途径ACC合成酶乙烯形成酶甲硫氨酸S-腺苷甲硫氨酸ACC乙烯（SAM）ACC：1-氨基环丙烷-羧酸（aminocyclopropanecarboxylicacid）问题：如何控制乙烯的合成？,4、利用反义技术控制果实的成熟,5、控制果实成熟的基因及其应用（1）ACC合成酶反义基因及其应用ACC合成酶是乙烯合成过程中的关键酶，至今已从苹果、番茄、香蕉等多种植物中克隆了ACC合成酶基因。番茄果实成熟期间表达2种ACC合成酶，编码基因分别是LE-ACC2和LE-ACC4，其中LE-ACC2与成熟有关，并被创伤诱导。,利用反义技术，将LE-ACC2的反义基因导入番茄后，几乎完全抑制上述两基因的mRNA积累。正常番茄果实在授粉后50天开始形成乙烯，并在随后的10天中成熟，而转基因植株的果实内乙烯合成被抑制了99.5%。此外，叶绿素降解和番茄红素合成也被抑制，即果实成熟的启动被延迟，果实不能自然成熟。,利用基因工程技术构建反义乙烯形成酶（EFE）基因载体，通过农杆菌Ti质粒介导转化，获得转基因番茄植株。变色期果实在25温度下，可贮藏4050天，较对照延长贮藏期2030天。,转基因耐贮存番茄-华番一号,（2）PG反义基因及其应用：PG即多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）,是一种细胞壁结构蛋白。其作用：降解果胶或果胶酸。催化果胶分子多聚-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解及果胶的降解，使细胞壁结构解体，导致果实软化。,1998年，Smith等人用PG的cDNA的5末端的730bp或一个含有PG整个读码框的1.6kb的cDNA片段构建PG的反义基因，导入番茄中（启动子为CaMV35S），转基因植株的PG活性仅为正常的10%。与对照比较显示，转基因果实在成熟过程中的表现没有明显差异，果实软化过程和贮藏果实的硬度没有明显差异，,但转基因果实抗裂、抗机械损伤能力比非转基因果实强等，果实的保鲜期延长1倍。此外，2003年中国农大的博士生寇晓虹进行的转反义PG基因的研究也获得相似的结果。,（七）改良作物品质的基因及其应用谷物种子贮藏蛋白基因、控制脂肪酸合成的基因、改良淀粉品质的基因及提高必须氨基酸含量的基因。,二、DNA体外重组即目的基因与载体连接构建重组DNA分子的过程。目的基因与载体的酶切：单酶切和双酶切目的基因与载体连接：定向连接；非定向连接,（一）目的基因与载体的酶切要求在载体与基因上只有一个识别位点。单酶切：优点可以直接连接、比较简便，可用相同的酶再消化。缺点：载体易自身环化、不能定向克隆、大片段DNA的重组率较低，重组体可能是多片段或多个载体的串联重组体。,克隆载体,双酶切：用两个不同的酶切割优点：外源DNA可以定向插入载体。缺点：没有单酶切简便，也可以用同尾酶消化，但重组体不能用相同的酶再切割。,如：分别双酶切载体和目的基因以便下一步的定向连接,（二）DNA的连接方法两种不同的DNA分子的连接根据其末端结构可选用不同的方法进行连接。1.直接连结法：适用于（1）同种限制酶消化不同DNA片段产生的相同粘性末端重组DNA可用同种酶再切开,但识别简并序列的限制酶除外(如AraI),EcoRI等产生的5粘性末端：5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5EcoRI375G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C5退火4-75G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C5,（2)不同种限制酶切割DNA片段产生的相容性末端i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:SalI/XhoIii.重组DNA分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能性较小,如MboI/BamHI5SalIGTCGAG33CAGCTC55GTCGAG33CAGCTC5,双酶切：目的基因定向连接到表达载体,（3)PCR产物与T-载体的直接连接,（4）限制酶和其他方式产生的平整末端载体与外源DNA为非互补的粘性末端：先将其修饰成平头末端再连接：1）5突出末端补平：使用Klenow补平532）3突出末端切平：使用S1核酸酶切平平末端可以直接连接，但效率相对比较低,5,3,5,3,3,5,在DNA平末端加人工接头产生粘性末端1）DNA连接子（linker）：是一段人工合成的具有平头末端的双链DNA片段，长度为8-12个bp，其上有一个或数个识别位点。如：5-CCGGAATTCCGG-33-GGCCTTAAGGCC-5作用：在DNA末端添加1个酶切位点，以产生粘性末端，有利于连接。,注意事项：接受linker的DNA片段必须是平头末端linker的5端必须带有P基团才能进行连接。目的DNA片段中，若存在与linker相同的酶切位点，在加linker前需先进行位点甲基化修饰。linker与DNA片段的连接为平末端连接，但效率比较高linker自身也会形成链状结构，但对后续实验影响不大。,三、重组DNA向细菌转化的原理和方法转化：把以质粒为载体的重组DNA分子导入受体细胞的过程称为转化。转染：把以噬菌体或病毒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程称为转染。,（一）重组DNA转化细菌的方法：CaCl2转化法转入大肠杆菌电击转化法三亲交配法转入农杆菌冷冻法电击转化法,1、CaCl2转化法Ca2+诱导转化法适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），197