原位杂交实验

荧光原位杂交（FISH）的实验步骤 FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互 补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定 量。试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4保存备用。（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60烘干过夜备用。（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250烘干4h以上或200过夜。称量试剂勺也 要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液 1PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水； 3PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水； 通常配制成10PBS的储备液，3PBS和1PBS可用DEPC水稀释获得。（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA） 称取2gPFA加入30ml约60的热水，滴几滴20%NaOH放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。然后向其中加入16.5ml 3PBS缓冲液，在冰浴中充分混匀冷却，冷却后，用HCl调整至中性（7.2左右），拿出搅拌子。向PFA溶液中加入超纯水，定容在50ml。用 0.45微米的膜过滤后使用。（室温或4保存备用）。注意： 1、配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用； 2、加热时，温度不宜过高，常为6065，否则，PFA降解失效； 3、配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，应尽早使用。 4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。样品固定时间在23小时，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。（c）配制50%，80%，98%无水乙醇溶液，每个总量20mL。（d）DAPI溶液 用1mlddH2O将DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液（1mg DAPI/1mL H2O）。（DAPI不能直接用PBS等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解）。取适量DAPI水溶液加到PBS中，制备成1050 M的DAPI溶液。3）取样及保存方法（a）反应器沉淀前取样25mL至离心管。（b）离心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸馏水重复两次）。（c）样品加入1mL多聚甲醛，摇匀，4下放置3h。（d）样品离心(12000r/min)5min，去上清夜。（e）加入1PBS，摇匀，离心(10000r/min)5min，去上清夜（重复3次）。（f）加0.5mL 1PBS，0.5mL无水乙醇，摇匀，-20保存（可保存6个月）。4）样品固定： 稀释样品35倍，对样品进行超声处理（3W超声23min，沉降1min，去沉淀物，5W超声5min），将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜 计数。然后取3L样品涂于包埋明胶的玻片上（检查样片本底），37的热烘箱固定2h（或者在空气中干燥2h或者过夜）。依次用50%、80%、98% （质量比）乙醇浸渍3min，对细胞进行脱水后，立放，并进行干燥。5）样品杂交 试验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液（Hybridization Buffer, HB）和淋洗缓冲液（Washing Buffer, WB），其组分如表1-1和表1-2。表1-1 杂交缓冲液（Hybridization Buffer）5%10%20%30%35%40%0.05%SDS（L）1.21.21.21.21.21.250mMTri-HCl（L）2424242424245mol NaCl（mL）4.324.324.324.324.324.32甲酰胺（mL）1.22.44.87.28.49.6蒸馏水（mL）18.454817.254814.854812.454811.254810.0548探针Nsm156Ntcoc206Ntspn693Nsv443Ntspa662 NSO1225 NmvNIT3表1-2 淋洗缓冲液（Washing Buffer）组分体积0.05%SDS0.6L50m MTri-HCl12L5mol NaCl2.16mL蒸馏水42.8274mL（a）吸取2mL杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在46杂交炉中放置数分钟。（b）吸取10L探针贮存液和80L杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入46杂交炉中预热数分钟；探针贮存液浓度为25ng/L，用无菌水稀释购买的探针，实验用的探针序列及杂交条件见表1-3所示。表1-3用于检测样品中AOX、NOX的寡核苷酸探针及杂交条件探针探针序列(53)标记细菌种属浓度aNSO1225CGCCATTGTATTACGTGTGAAmmonia oxidizing beta-proteobacteria35Nsv443CCGTGACCGTTTCGTTCCGNitroso-spira, -lobus, -vibrio30NmvTCCTCAGAGACTACGCGGNitroso-coccus35Ntspa662GGAATTCCGCGCTCCTCTNitrospira35NIT3CCTGGCTCCATGCTCCGNitrobacter40Ntcoc206CGGTGCGAGCTTGCAAGCNitrococcus mobilis10Ntspn693TTCCCAATATCAACGCATTNitrospina gracilis20注：（a） 表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度（%）（c）吸取9L预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于46下进行杂交（黑暗中进行），杂交时间为23h；（d）杂交后的洗脱：打开恒温水浴槽，加热到48，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后，快速放入淋洗缓冲液，48水浴20min后用4冰水，冲洗样品，样品洁净台中挥干。DAPI染色每孔滴9uLDAPI，4暗处5min，4冰水（BPS缓冲溶液）冲洗，挥干。用带有360 nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全细胞计数。封片涂封片剂，盖盖玻片，