牛血中SOD的分离纯化步骤

1.前言超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD，EC l.15.1.1)广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种能专一地清除超氧阴离子自由基(O2)的金属酶1。按所含金属离子不同可分为CuZnSOD、MnSOD 和FeSOD2。SOD催化反应：2H+2O22H2O2+O2。SOD对过量的O2的及时清除保证了机体内O2的含量相对平衡，对机体起防护作用3。国内外研究表明SOD具有抗炎、抗衰老抗辐射4等重要作用5。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关进展报道。许平6、袁艺7、赵文芝8、余旭亚9等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取出SOD并进行相关研究。SOD 的制备方法随原料而异，目前国内外制备SOD 的原料有动物血10、微生物和动植物组织。牛血通常不会进行再加工，本文旨在通过牛血中SOD的研究，为牛血SOD的开发利用提供依据。2.材料与方法2.1材料2.1.1仪器50 ml离心管 ，500 ml烧杯，200 ml烧杯，电子天平，冷冻离心机，试管，恒温水浴锅，紫外分光光度计，电泳仪，垂直电泳槽，培养皿（染色用），移液器（1000ul、100ul、50ul、10ul），YC-1层析柜，混合器，恒流泵，紫外检测仪，自动收集装置，记录仪等。2.1.2材料 新鲜牛血（购于北京市牛街），Sephadex G-100 凝胶2.1.3试剂(1) 磷酸缓冲液（pH7.6、2.5mmol/L）(2) 考马斯亮蓝G-250试剂：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml 85%的磷酸，蒸馏水定容至1000 ml。此试剂常温下可保存30天。(3) 标准蛋白(BSA)标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25 mg，加蒸馏水溶解并定容至100 ml。吸取上述溶液40 ml，用蒸馏水稀释至100 ml，即为100 ug/ml的标准蛋白质溶液。(4) SOD活力测定试剂50 mmol/L pH 8.2TrisHCl缓冲液（Tris 0.61g，EDTANa2 0.037g，0.1mol/L HCl调PH8.20，定容至100ml）；45mmol/L邻苯三酚溶液（用10 mmol/L盐酸配制）。10 mmol/L盐酸。(5) 40%蔗糖：称取40 g蔗糖加重蒸水100 ml。(6) 10%过硫酸铵(AP)：称过硫酸铵10g，溶于100 ml重蒸水中。用时现配。(7) 电极缓冲液：称取Tris (三羟甲基氨基甲烷) 6g，甘氨酸28.8g。用蒸馏水溶解并定容至1000 ml。用时稀释10倍。(8) 胶贮液（30%的Acr/Bis溶液）：称丙烯酰胺Acr 29.1 g，甲叉双丙烯酰胺Bis 0.9g，加重蒸水溶解，定容至100ml，过滤后装入棕色瓶，4保存。(9) 分离胶缓冲液：Tris（三羟甲基氨基甲烷）36.6g，加1 mol/L HCl 48 ml，用浓盐酸调pH8.9，再用蒸馏水定容至100 ml。(10) 浓缩胶缓冲液：Tris 6.0 g，加1 mol/L HCl 48 ml，TEMED 0.4 ml，用浓盐酸调至pH6.8后，再用蒸馏水定容至100 ml。(11) 脱色液：乙酸。(12) TEMED 2.2方法2.2.1收集红细胞、溶血取加入抗凝剂的新鲜牛血300ml，充分摇匀，3000r/min离心20min除去血浆，收集沉淀（红细胞），加入等体积0.9%NaCl溶液，用玻璃棒搅起充分洗涤，3000r/min离心20min，弃去上清液（重复3次，上层液体为淡黄色），收集洗净的沉淀（红细胞）放入500ml烧杯中，加入等体积ddH2O，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血30min，得溶血液约200ml，放入YC-1层析柜中（04）过夜，使红血球充分破裂。2.2.2沉淀血红蛋白向溶血液中加入4下预冷的95%乙醇（0.25倍体积，50ml），然后再缓慢加入4下预冷的氯仿（0.15倍体积， 30ml），搅拌45min，静置2h，冷冻3500r/min离心20min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上清液85ml，此即酶的粗提液。上清继续冷冻3500r/min离心20min。2.2.3 SOD富集向酶粗提液加入35g K2HPO43H2O（按43gK2HPO43H2O：100ml粗提液的比例），充分搅匀，转移到分液漏斗，震摇后静置15min，见明显分层。收集含SOD上层乙醇-氯仿相（微浑浊，42ml），室温下3500r/min离心25min，弃去沉淀，得上清液约40.5ml。2.2.4 SOD纯化2.2.4.1沉淀。在上清液中加入等体积4预冷的丙酮40ml，搅拌均匀，YC-1层析柜中静置20min，3500r/min离心20min收集沉淀物。2.2.4.2溶解。向沉淀中加入少量去离子水溶解，4500r/min离心20min，合并两次上清，共23ml。2.2.4.3热变性11。向溶液中加入CuCl2H2O（按40gCuCl2H2O：100L原血），在60水浴中保温10min，冷却至室温，4000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液30ml。2.2.4.4再沉淀。在上清液中加入4倍体积4预冷的丙酮，使丙酮含量为80%，10000r/min离心10min收集沉淀。用2ml水溶解。装入截留量为10000道尔顿的透析袋中，于2.5mmol/LpH值为7.6的磷酸缓冲液中透析过夜， 4000r/min离心30min，弃去沉淀物，收集上清液3.5ml。2.2.5 Sephadex G - 100柱层析纯化12Sephadex G - 100分子筛柱层析(20 cm 2 cm) 。用pH7.6、量浓度为2.5 mmol/L的磷酸缓冲液平衡洗脱，上样体积为3ml，自动部分收集器收集，控制流速为4 ml /10 min，每管收集4 ml，分光光度计测定各管A280值(牛血Cu-Zn-SOD的最大吸收波长为260nm，280nm吸收峰不明显，在此处测定有一定影响) 13，并测定各管活性，合并活性峰管，冷冻干燥。2.3蛋白质含量测定（微量考马斯亮蓝G -250法）2.3.1标准曲线的制作取6支具塞试管，编号，按表1加入试剂：表1 微量考马斯亮蓝G -250法加样表Tab.1 Micro-Coomassie brilliant blue G -250 method试剂标号123456 蛋白质标准液/ml 0 0.01 0.03 0.05 0. 07 0.09 蒸馏水/ml 0.1 0.09 0. 07 0.05 0.03 0.01 考马斯亮蓝G-250/ml555555 蛋白质含量/ug 013 57 9 盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。放置10 min，在595 nm波长下比色测定光吸收值，比色应在l h内完成。以牛血清白蛋白含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。2.3.2样品中蛋白含量的测定将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取1支试管，淮确加入0.1 ml样品提取液，加入0.9 ml蒸馏水和5 ml考马斯亮蓝G- 250试剂，其余操作与标准曲线制作相同（样品有粗酶液、硫酸铵盐析液、Sephadex G - 100，DEAE-52 ）。2.3.3结果计算根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（ug）。2.4 SOD活力测定162.4.1邻苯三酚自氧化率的测定（Trace Pyrogallol method）取4.5 ml 50 mmol/L pH8.2 TrisHCl，然后加入25预热过的邻苯三酚溶液10ul，迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯内，用10 nmol/LHCl作空白，325 nm波长下每隔30 s测光吸收值一次，整个操作在4 min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在0. 070（OD值）/min左右。2.4.2酶活力测定操作与上面基本一致，加入邻苯三酚前，先加入SOD样液10ul，测其光吸收值控制其自氧化速率在35%65%，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。2.4.3酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：SOD活力（U/ml）=M式中，A0：为邻苯三酚自氧化率： AM：加酶后邻苯三酚自氧化率； V总：反应总体积； V样：加入样品液的体积； V定义：活性单位定义体积1 ml； M：样品稀释倍数。 样品SOD比活力(U/mg)=单位体积活力(U/ml )/C式中，C：每ml样品液蛋白质含量(mg)。SOD总活性(U)=单位活性酶原液总体积。2.5 SOD纯度鉴定2.5.1样品制备 取一定体积酶液，按酶液：40%蔗糖=1:1（体积比）的比例配成样品液，备用。2.5.2凝胶的制备表2 胶制备加量表Tab.2 Polyacrylamide gel-like form increases试剂编号分离胶浓缩胶30%的Acr/Bis溶液/ml4.00.86pH8.9分离胶缓冲液/ml2.5pH6.8浓缩胶缓冲液/ml0.63H2O/ml3.33.710%SDS /ul1005010%过硫酸铵(AP)/ml10050TEMED/ul552.5.3加样及电泳将电泳槽注满电极缓冲液，分