分析化学 第十一章 荧光分析法..ppt

第十一章荧光分析法,本章基本要求：理解分子荧光的基本原理；理解分子荧光激发光谱、发射光谱的含义；掌握分子荧光发射光谱的特征；了解荧光光谱仪的组成及部分作用；掌握荧光分析法的主要应用范围。,第一节荧光分析法的基本原理,一、分子荧光分子荧光的产生分子吸收电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历碰撞及发射的去激发过程。一般用Jablonski能级图来定性描述分子吸收和发射过程。分子的电子能级与激发过程物质的分子体系中存在着电子能级、振动能级和转动能级。由于一般的光谱仪器分辨不出转动能量，因而Jablonski能级图中未画出转动能级。,若分子的电子数是偶数，则分子中电子净的自旋之和为S=0，即基态分子的电子是自旋成对的。由分子多重性的定义有M=2S+1=1,称之为单重态。基态单重态以S0表示，S1和S2则分别代表分子的第一和第二激发单重态。当分子处于激发态时，若分子的电子自旋与基态相同，仍然是单重态，即分子处于S1和S2。,在激发态中，分子的某个电子也有可能改变自旋，即自旋平行则S=1，所以多重性M=2S+1=3,分子处于这样的激发态称为三重态，图中最低三重态以符号T1表示，T2代表较高的激发三重态。由于自旋平行比自旋配对的状态更稳定，故三重态的能级比单重态的能量略低。每个电子能级都有多个振动能级，在同一个电子能级中，最低的线代表该能级的振动基态。吸收过程发生在10-15s左右的时间内。,分子吸收和发射过程的Jablonski能级能级图,S0,3210,3210,T2,S1,3210,21043210,S2,T1,1234吸收吸收荧光磷光,分子的去激发过程,分子被激发到较高的能级后不稳定，将以不同途径释放多余的能量回到基态，该过程为分子的去激发过程。去激发包括下面几个可能的途径。振动弛豫在凝聚相体系中，被激发到激发态的分子通过与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能量传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。振动弛豫过程发生大约为10-12s。,内部能量转换,当S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上该过程为内部能量转换。内转换发生的时间约为10-12s。内转换过程同样也发生在激发三重态的电子能级间。,由于振动弛豫和内转换过程极为迅速(10-12s),因此，激发后的分子很快回到第一激发单重态S1的最低振动能级。所以高于第一激发态的荧光发射十分少见。,荧光发射,当分子处于第一激发单重态S1的最低振动能级时，分子可能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上，这个过程称为荧光发射。荧光发射过程约为10-8s.外部能量转换激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭”或“熄灭”。,体系间跨越,系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多重性发生变化的结果。当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几率增大。S1T1即是单重态到三重态的跃迁，即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠，这种跃迁是“禁阻”跃迁。,磷光发射,激发态分子经过系间跨越到达激发三重态后，并迅速的以振动弛豫到达第一激发三重态(T1)的最低振动能级上，第一激发三重态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光。磷光发射是不同多重态之间的跃迁(T1S0)属于“禁阻”跃迁，因此磷光的寿命比荧光要长的多，约为10-3s10s。所以，将激发光从磷光样品移走后，还常可观察到发光现象，而荧光发射却观察不到该现象。,二、荧光寿命和荧光效率,荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要发光参数荧光寿命荧光寿命是当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，常用f表示。当荧光物质受到一个极其短暂的光脉冲激发后，荧光强度的变化可用下列公式表示：,若t=f,此时Ft=（1/e）F0，则上式为：则K=1/f，将其带入则得：以对t作图，直线斜率即为：1/f,由此计算荧光寿命。利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光混合物的分析。,荧光效率荧光效率也称荧光量子效率，是发射荧光的分子数与总的激发态分子数之比。也可定义为物质吸光后发射的荧光的光子数与吸收的激发光的光子数之比。荧光的去激发过程：发射荧光返回基态(强的荧光物）无辐射跃迁回到基态(低荧光物质),荧光效率与荧光发射过程的速率及无辐射过程的速率有关。式中，Kf是荧光发射过程速率常数，Ki是系间跨越和外转换等有关无辐射跃迁过程的速率常数总和。其中Kf主要取决于分子的化学结构，而Ki主要取决于化学环境。化学环境能使体系的Kf升高、Ki降低，从而可使体系的荧光增强；反之，则使体系的荧光减弱。,三、荧光的激发光谱和发射光谱任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激发光谱和荧光光谱。荧光激发光谱激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波长而获得的荧光强度(F)激发波长(ex)的关系曲线。激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对效率。激发光谱可以用于荧光物质的鉴别，并作为进行荧光测定时供选择恰当的激发波长。,荧光发射光谱通过固定激发波长，扫描发射(即荧光测定)波长所获得的荧光强度(F)发射波长(em)的关系的曲线为荧光发射曲线。荧光光谱反映了在相同的激发条件下，不同波长处分子的相对发射强度。荧光光谱可用于荧光物质的鉴别，并作为荧光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。,同步荧光光谱1971年Lloyd提出用同步扫描技术来绘制光谱图。该技术是在同时扫描激发和发射单色器波长的条件下，测绘光谱图，所得到的荧光强度激发波长(或发射波长)曲线为同步荧光光谱。荧光信号同步信号,测定同步荧光光谱的三种方法：固定波长同步扫描法：在扫描过程中，激发波长和发射波长有一个固定的波长差，即=emex=常数固定能量同步扫描法：使发射单色器与激发单色器之间保持一个恒定的波数差，即（1/ex1/em）107=常数。可变波长同步扫描法：使两单色器在扫描过程中以不同的速率同时进行扫描，即波长可变。,同步荧光光谱的特点：使光谱简化；使谱带窄化；减小光谱的重叠现象；减小散色光的影响。这种光谱提高了分析测定的选择性，避免了其它谱带所引起的干扰。但对光谱学的研究不利，因为它损失了其它光谱所含的信息。,四、荧光光谱的特征,斯托克斯(Stokes)位移在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes位移。原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的位移。Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生的能量损失。（见P220图11-3）,镜像对称规则一般而言，分子的荧光发射光谱与其吸收光谱之间存在着镜像关系。（见P220图)镜像对称规则的产生是由于大多吸收光谱的形状表明了分子的第一激发态的振动能级结构，而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结构。一般情况下，分子的基态和第一激发单重态的振动能级结构类似，因此吸收光谱的形状与荧光发射光谱的形状呈镜像对称关系。,荧光光谱的形状与激发波长无关用不同波长的激发光激发荧光分子，可以观察到形状相同的荧光发射光谱。这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过程后最终回到第一激发态的最低振动能级。而分子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级跃迁到基态的各振动能级上。,五、影响荧光强度的因素,荧光是由具有荧光结构的物质吸收光后产生的，其发光强度与该物质分子的吸光作用及荧光效率有关，影响物质荧光强度的因素主要有两个：分子结构一般具有强荧光的分子都具有大的共轭键结构、供电子取代基、刚性的平面结构等。分子中至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物才容易发射荧光，而饱和的或只有孤立双键的化合物，不呈现显著的荧光。发光分子所处的环境荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影响。因此适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏度和选择性。,分子结构,跃迁类型：大多数荧光化合物多是由或n跃迁所致的激发态去活后，发生或n跃迁产生的。跃迁的量子效率高，是由于跃迁的摩尔吸光系数比n跃迁大1001000倍,跃迁的寿命(10-710-9s)又比n(10-510-7）跃迁寿命短，因此Kf较大；其次，系间跨越的速率常数小，有利于发射荧光。,共轭效应,含有跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强，最有用。含脂肪族和脂环族羰基结构的化合物也会发射荧光，但这类化合物的数量比芳香族少。稠环化合物一般会产生荧光。最简单的杂环化合物（吡啶、呋喃、噻吩、吡咯）等不产生荧光。当苯环被稠化至杂环核上时，吸收峰的摩尔吸光系数增加，因此喹啉、吲哚等会产生荧光。,取代基效应,苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变。给电子基团，使荧光增强。如:NH2,OH,OCH3,NHCH3和N(CH3)2等，吸电子基团，使荧光减弱如:Cl,Br,I,NHCOCH3,NO2和COOH等，。,分子的刚性效应,在同样长共轭分子中，分子的刚性越强，荧光效率越大。本来不发生荧光或荧光较弱的物质与金属离子形成配位化合物后，如果刚性共平面性增加，则可以产生荧光或增强荧光。如：8-羟基喹啉本身是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+形成配位化合物后，荧光增强。顺反异构体的荧光性,联苯,芴,=0.2,=1.0,环境因素,荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏度和选择性。溶剂效应溶剂的极性：溶剂的极性增大，跃迁的能量减小，红移。溶剂的粘度溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐射跃迁几率增加，荧光减弱。,温度的影响由于当温度降低时，溶剂的粘度增大，溶剂的弛豫作用大大减小，荧光发射几率增加；当温度升高时，碰撞频率增加，外转换的去激发几率增加，荧光发射几率变小。一般地，随温度降低，溶液中荧光效率和荧光强度将增大，并伴随光谱的蓝移。因此，选择低温条件进行荧光检测将有利于提高分析的灵敏度。,pH的影响对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言，溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的影响。如：在pH712的溶液中，苯胺以分子形式存在，产生蓝色荧光；当pH3、pH13时，苯胺以阳离子、阴离子形式存在，均无荧光。溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。,荧光猝灭荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互作用，使荧光强度减弱的作用。荧光猝灭剂：能引起荧光强度降低的物质。动态猝灭：被激发的荧光分子与猝灭剂发生碰撞，使荧光分子以无辐射形式跃迁回到基态而使荧光猝灭。静态猝灭：荧光分子与猝灭剂形成不发光的基态配合物从而使荧光猝灭。氧是最常见的碰撞猝灭剂，因此在较严格的荧光实验室中，需要除氧。利用荧光的这两种猝灭作用可以检测猝灭剂的浓度。,自猝灭：当荧光物质的浓度较大时，会产生激发态的荧光分子与基态的荧光分子碰撞从而使荧光猝灭。因此在荧光测量中，荧光物质的浓度不应太大。当物质中存在能与荧光分子发生能量转移的物质时，有时也使体系的荧光强度下降。,内滤作用内滤作用：当溶液中存在能吸收荧光物质的激发光或发射光的物质时，会使体系荧光减弱的现象。散射光散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光。选择适当的激发波长可消除此干扰。例：见书224225页,第二节荧光定量分析方法,一、荧光强度与物质浓度的关系I0IF在ECl0.05时，F=KC,溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；在ECl0.05，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度不呈线性关系；荧光分析法的测定灵敏度高。,二、定量分析法,校正曲线法比例法联立方程式法,第三节荧光分光光度计第四节荧光分析新技术简介,掌握内容：分子荧