BrdU染色原理和步骤.ppt

BrdU染色原理和步骤,YTH-xianyuanruxia,EdU染色方法简介,BrdU染色原理,BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活细胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中（细胞周期S期）。这种掺入可以稳定存在，随着DNA复制进入子细胞中。BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。,活体注射或细胞培养后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。因组织细胞内无内源性Brdu存在，所以Brdu应用较广掺入双链DNA内的Brdu，以氢链与腺嘌呤结合，不能直接与抗Brdu抗体反应，需经解链使Brdu暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，抗Brdu小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的Brdu结合，再经酶标抗小鼠IgG抗体孵育、呈色，显示进入S期细胞的情况。,改进和发展,由于盐酸和蛋白酶处理等可引起抗原或组织形态发生变化。为此，Conchoroff(1985)等制备了一种单克隆抗体（Bu1），其培养液上清能与双链DNA的Brdu反应，因为培养液上清中含有DNA酶，可分解双链DNA，显露Brdu，达到染色目的。采用戊二醛固定后，胃蛋白酶盐酸处理，亦得到了良好的染色结果。用双重或多重染色、观察何种细胞分裂增殖时，首先应染色其它抗原物质，最后显示Brdu。通常在第一种抗体呈色后，再经1%戊二醛固定510min，重复染色程序，均可获得较满意的染色结果，分裂细胞核呈棕褐色；显示其它抗原用ALP标记抗体，则细胞浆为红色（FR）或蓝色（FB）,操作步骤（1）,（1）细胞以1.5105/ml细胞数接种于直径35mm培养皿中（内放置一盖玻片），培养1d，用含0.4FBS培养液同步化3d，使绝大多数细胞处于G0期。（2）加入BrdU（储液：1.0mg/ml,终浓度为0.03g/ml），37，孵育40min。（3）弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。（4）甲醇/醋酸固定10min。,（5）经固定的玻片空气干燥，0.3H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。（6）5正常兔血清封闭。（7）甲酰胺100，5min变性核酸。（8）冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。（9）按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。,BrdUstainingprotocol,MaterialsandreagentsHydrogenchloride(HCl),1Mand2MBoratebuffer0.1MBorax(sodiumtetraborate)38.1g/liter,pHto9.0Phosphate-bufferedsaline(PBS),pH7.4,with0.1%TritonX-100,Method,1.Sectionsofparaffin-embeddedtissuesshouldbede-waxedbeforeproceeding.2.IncubateinHCl(1M)for10minonicetobreakopentheDNAstructureofthelabeledcells.3.ThisisfollowedbyHCl(2M)for10minatroomtemperature,then20minat37C.4.Immediatelyaftertheacidincubations,neutralizebyincubatingthesamplesinboratebuffer(0.1M)for10minatroomtemperature.5.WashinPBS(pH7.4),0.1%TritonX-1003times,5minperwash.6.Continuewithstandardstainingprocedureasdescribedintheimmunohistochemistryandcytochemistryprotocols.,注意事项,1.BrdU配制方法：10mg溶于10ml双蒸水，4下避光保存2.BrdU会肌体造成不可逆损伤，使用时注意安全，避免吸入BrdU粉尘。,BrdU染色的进化-EdU,EdU（5-Ethynyl-2-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于Apollo荧光染料与EdU的特异性反应即可