CR引物设计及相关软件数据裤的使用.ppt

分子生物学实验课,1、欢迎大家参加分生实验的学习；2、学习分生实验的重要性；3、课堂上守纪律，听老师安排，做实验穿白衣；4、每组做一份实验5、上课时间：上午8:00,下午13:00.6、每天实验结束应主动整理实验台，值日安排。,实验仪器的使用及注意事项,加样器离心机,一、加样器1、用途2、如何使用？,根据取样量，选择合适的加样器。,顶部标有加样器的最大量程，分别为：20ul:0.520l100/200ul:20100/200l1000ul:200ul1000l,5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器?,练习：加样器读数为100，实际体积各为多少?,(1)首先观察目前读数,假设为050:1000l:500l100/200l:50l20l：5l(2)顺时针调节-读数变小逆时针调节-读数变大(3)加样器读数处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，超出量程，将会损害加样器的精度。,如何调节加样器。,1）选择加样器观察读数；调节读数；2）安装吸头（紧密）；3）吸取液体按加样器第一挡；将吸头插入液面下适当深度；松开拇指（缓慢）,吸取液体4）打出液体抬起加样器；估计体积是否正确；移入容器；按到加样器第二档；打出液体（匀速）,加样器使用步骤(示教及学生练习)：,加样器使用注意事项：,1）吸头的安装（紧密）不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下2）吸取液体枪头不能插入过深或过浅，过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。吸取完液体后，估计体积的准确性（加样器可能会不准）吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！3）打出液体观察吸头内液体是否完全打出,1、打开电源2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。,1代表转速盘上方的数据2代表下方的数据。,3、样品配平,对称放入离心机(管的连接处朝外).,二、离心机,4、设定时间(旋转时间转扭，然后自己记时间）。5、统一离心，逐渐升到要求转速。,六个小组统一用一个离心机一起离心,实验课的整体安排,基因克隆,3天.RNA提取逆转录及PCR,重组质粒,5天.重组质粒提取及酶切,TA连接,T载体,转化，,平板筛选,2天，基因组DNA提取及酶切后电泳离,1天.序列查找及引物的设计,4天,PCR引物设计及相关软件数据库的使用,本次实验课课件不允许拷贝,介绍如何查找基因的序列,介绍NCBI的数据库，及检索页面,介绍如何设计PCR引物，及设计引物的注意事项,扩增目的基因的全长,扩增目的基因的任意一部分,讲解的内容（上午）,介绍常规的生物学软件的使用,Primer5.0;Oligo6.0;Blast;PCRDESIGN；,讲解的内容（上午）,(一）如何查找基因的序列,观看录像,GenBank数据库,GenBank-序列数据库,GenBank-是NIH遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列的注释过的收集,网址：/,1.打开/,网络演示,1.根据文献,如果你在文献种看到你感兴趣的基因，而且文中还提到在Genbank中的ID号直接打开/，在search后下拉框只中选择Nucleotide，把GnebankID号（AJ318831.1)输入GO前面的文本框中，点Go就可以找到了。,例如：在2012年发表Biotechlogyletters文章(TheFMDVserotypebovineOFMDVusedtochallengesucklingmicewasstrainO/CHA/2/99(GenBankNO.AJ318831.1).,，在Search后的下拉框中选择Nucleotide，把GenbankID号输入GO前面的文本框中，点“GO”，就可以找到他了,注意：同学们应该学会看Genbank数据库中基因的ID号,打开/,在search后面的下拉框中选择Gene，然后在中间的文本框中输入基因名称“IFN-gamma”，点击GO.,2.从Gene数据库中直接查找序列,检索42项，哪一条是呢？（这也许是大多数人对Genbank的第一印象，东西太多，不知道是哪一个。）利用limits高级检索,Limits的意思其实就是高级检索，你可以在这里对检索词进行很多限制，这样能大大精简查询结果。,这样就能获得我们所想要寻找的基因信息。提醒：注意一下右侧的基因相关信息，很有用的。,可以看到Genomicregions,transcripts,andproducts，这里显示了该基因在基因组中的位置，以及转录本的生成情况：,若你只想获得序列（例如设计PCR引物，可以选择FASTA格式。FASTA格式的序列文件，没有其他数字和格式的干扰。,在获得FASTA格式的序列后，需要关注一下Genebank中CDS的信息，来确认该基因的编码序列。,IFN-cDNA的编码序列,atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggctgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcaaggtcgaagagcatcccagtaa,3.从Nucletide数据库中直接查找序列,打开/,在search后面的下拉框中选择Nucletide，然后在中间的文本框中输入基因名称“IFN-gamma”，点击GO.,与gene数据库进入，查找的序列是一样的。,2.从Gene数据库种查找基因序列的优势：,可以查看基因在基因组中的位置,可以查看基因转录本的生成情况，因为有的基因有多种mRNA,根据具体的课题需要选择mRNA剪接体，并选择其对应的编码序列,Gene数据库与Nucleotide数据库查找基因序列的区别,1.从Nucleotide数据库种查找基因序列的优势：,直接查看基因的mRNA序列，查找方式比较简单，快速,TNF-alpha有七个mRNA剪接体。,(二）如何设计PCR引物,观看录像,什么是引物？引物设计的原则是什么？介绍常用的引物设计的软件。引物同源性分析,介绍内容,引物是人工合成的两段寡核苷酸序列。,什么是引物？,PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合。PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸。,PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。,PCR反应需要两种引物，分别为5引物和3引物，或称为正向引物和反向引物。,引物设计的原则,3,5,5,3,5,5,targetsequence,一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补。另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。,Genebank上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是正链（编码链）。靠近正链5端称为5引物，靠近正链3端称为3引物,正链,负链,首先回顾PCR原理：两条引物与模板结合的位置。,5引物,3引物,atgaaatatacaagt,gaagagcatcccagtaa,3,5,3,5,CTTCTCGTAGGGTCATT,下游(3)引物的结合,(1)5引物照抄，3引物互补倒读：,Genebank上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是正链（编码链）,(4)引物方向：53,(2)长度：特异性序列一般15-18bp.常18-27bp，应38bp。,(3)碱基分布：嘌呤，嘧啶随机分布；避免出现堆积现象。GC比值为45-55%。3端和5端引物具有相似的Tm值。Tm=4(G+C)+2(A+T)。,(5)引物的3端：严格与模板DNA配对。尤其是引物3末端连续8个碱基要与模板严格互补。否则影响DNA聚合酶的延伸引物3端要避开密码子的第3位,引物5端修饰包括：加酶切位点；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。标记生物素、荧光、地高辛等；,(6)引物的5端：,引物的5-端设计限制性酶切位点后PCR示意图,第一次循环,第二次循环,第三次循环,(7)引物内部不应存在互补序列。以避免折叠成发夹结构(Hairpin),不能有连续5个碱基的互补。引物末端一般不达到3bp。,(8)引物间不应存在互补序列.尤其应避免3端的互补，以免形成引物二聚体,(9)比较引物与基因组的同源性,引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。与模板之间的特异性结合序列一般不少于15-18bp。,引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。,利用Blast来分析引物与基因组的同源性稍后在讲,已知IFN-cDNA序列,你该如何设计引物？,举一个实例：,1.设计PCR引物-扩增目的基因的全长,2.设计PCR引物-扩增目的基因的部分,扩增目的基因的全长,1.一般情况下，5引物需位于编码基因的起始密码子的位置，3引物位于编码基因终止子的位置。,2.引物的5端需加入多克隆酶切位点，方便后续的基因克隆操作。,3.注意：保证基因的阅读框架的不能改变。,5ATGAAATATACAAGTTATATCT.TCGAAGAGCATCCCAGTAA33TACTTTATATGTTCAATATAGA.AGCTTCTCGTAGGGTCATT5,第一步：扩增IFN-基本序列,变性,引物复性,atgaaatatacaagt,gaagagcatcccagtaa,atgaaatatacaagt,3,5,3,5,上游(5)引物的结合,CTTCTCGTAGGGTCATT,下游(3)引物的结合,IFN-序列,5引物：5-ATGAAATATACAAGT3,3引物：3-TTACTGGGATGCTCTTC3,特异性序列是否少了点?,startcodon,stopcodon,5引物照抄3引物互补倒读,第二步：GC比值；Tm值,5引物：5-ATGAAATATACAAGT3,3引物：3-TTACTGGGATGCTCTTC3,GC比值太少,GC比值太多,5引物：,5GCAGCGGATCCATGAAATATACAAGT3,GC=11AT=15,3引物:,5ATCGGAATTCTTACTGGGATGCTCTTC3,BamHI,GC=12AT=15,EcoRI,-加酶切位点或G,C,第三步：检测引物的发夹结构，二聚体等。,1.肉眼观察。,2.利用软件检测，稍后在软件使用中讲解。,经过上述三个步骤后，即将获得扩增IFN-gamma全长的引物：,5引物：,5GCAGCGGATCCATGAAATATACAAGT3,3引物:,5ATCGGAATTCTTACTGGGATGCTCTTC3,然后可以将序列信息送到生物公司进行合成。,一对引物约30元人民币,扩增目的基因的部分序列,3.根据PCR产物的长度，选择5引物和3引物的在编码基因中的位置：常规PCR反应中：PCR产物的长度300bp左右；实时定量PCR反应中，PCR产物的长度约150bp左右。,1.引物的位置最好在cDNA保守区的位置进行设计。,2.一般情况下，在设计RT-PCR引物时，5引物和3引物的距离之间跨越1-2个内含子。,Extron1,intron1,Extron2,5,3,DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对，各基因相同的序列就是该基因的保守区。,Homosapienshighmobilitygroupbox1(HMGB1),mRNANCBIReferenceSequence:NM_002128.4gi|118918424|ref|NM_002128.4|Homosapienshighmobilitygroupbox1(HMGB1),mRNATGGAGAGTAATGTTACAGAGCGGAGAGAGTGAGGAGGCTGCGTCTGGCTCCCGCTCTCACAGCCATTGCAGTACATTGAGCTCCATAGAGACAGCGCCGGGGCAAGTGAGAGCCGGACGGGCACTGGGCGACTCTGTGCCTCGCTGAGGAAAAATAACTAAACATGGGCAAAGGAGATCCTAAGAAGCCGAGAGGCAAAATGTCATCATATGCATTTTTTGTGCAAACTTGTCGGGAGGAGCATAAGAAGAAGCACCCAGATGCTTCAGTCAACTTCTCAGAGTTTTCTAAGAAGTGCTCAGAGAGGTGGAAGACCATGTCTGCTAAAGAGAAAGGAAAATTTGAAGATATGGCAAAAGCGGACAAGGCCCGTTATGAAAGAGAAATGAAAACCTATATCCCTCCCAAAGGGGAGACAAAAAAGAAGTTCAAGGATCCCAATGCACCCAAGAGGCCTCCTTCGGCCTTCTTCCTCTTCTGCTCTGAGTATCGCCCAAAAATCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGTCCATTGGTGATGTTGCGAAGAAACTGGGAGAGATGTGGAATAACACTGCTGCAGATGACAAGCAGCCTTATGAAAAGAAGGCTGCGAAGCTGAAGGAAAAATACGAAAAGGATATTGCTGCATATCGAGCTAAAGGAAAGCCTGATGCAGCAAAAAAGGGAGTTGTCAAGGCTGAAAAAAGCAAGAAAAAGAAGGAAGAGGAGGAAGATGAGGAAGATGAAGAGGATGAGGAGGAGGAGGAAGATGAAGAAGATGAAGATGAAGAAGAAGATGATGATGATGAATAAGTTGGTTCTAGCGCAGTTTTTTTTTTCTTGTCTATAAAGCA,编码区：164-811,黑色区域显示同源性较高的位置（bioEdit软件分析）,第一步.引物的位置最好在cDNA保守区的位置进行设计。,引物应该选择保守的位置，如150-370.,如：470-580.高度变异，引物不能选择这个位置。,当基因有多个mRNA剪接体时：,第二步.引物的位置最好跨越基因的一个内含子。,外显子的位置：（1-149,150-313,314-459,364-459,460-634.),上游引物位置.150-313区间内下游引物位置.314-370区间内,上一步同源性比较的结果150-370的位置为保守区：,可以选择：,上游引物位置.163bp-183bp下游引物位置.307-327,选择：,第三步.根据PCR产物的长度，选择5引物和3引物的在编码基因中的位置：,定量PCR反应中，PCR产物的长度约150bp左右，,第四步.根据引物设计软件对设计的引物进行检查（引物的GC比值，发夹结构，二聚体等）。,GCATGGGCAAAGGAGATCCTAA,TTAGCAGACATGGTCTTCCAC,引物设计软件,PCRDESIGN（分析评价引物的功能，简单方便）Oligo6.0（分析评价引物功能，最优秀）PrimerPremier5.0（自助搜索引物的功能）-生物软件网下载,PCRDESIGN软件使用介绍-检测引物,第一步。PCRDESIGN软件启动页面，输入A即可开始操作。,第二步。编辑-粘贴-输入上游引物与下游引物的序列，按enter键。,第三步。检测引物的是否有发夹结构（一般小于6个bp）,第四步。检测上下游引物之间是否有互补序列，即引物的二聚体（一般小于6个bp）。,第四步。检测上下游引物之间是否有重复序列（一般小于6个bp）。,第五步。检测上下游引物之间GC比值。,Oligo6.44软件使用介绍,Oligo6.44,主要功能：用于引物的检测,Opensequencefile,Oligo6.44启动界面,点击：接受accept.弹出三个窗口,其中一个是：Meltingtemperature一般情况下在这个窗口上工作。,编辑上游引物，输入上游引物在模板上结合的位置,1.上游引物位置.163bp-183bp，与模板结合的位置为163-1的位置，输入162.,2.上游与模板结合后，序列是完全一致的。,1.下游引物位置.307bp-327bp，与模板结合的位置为307的位置.,2.下游引物与模板结合后，序列是完全一致的。,引物分析,Hairpin,DimerandcrossDimer,GC%,TotalPCRinformation,1.检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。,2.发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好,3.检查为GC含量，以45-55为宜,4.检测与PCR其他模板上错配的位置。,1.引物二聚体分析,2.引物发夹结构分析,3.引物GC比值分析,4.引物在模板上错配概率,下游引物分析结果,PrimerPremier5.0使用介绍,PrimerPremier5.0使用介绍,主要功能：用于引物的检索,Chooseafunction,第一步.输入基因的序列,第二步.搜索上下游引物在基因序列中适合的位置。,第三步.引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,13个引物,引物分值100分为满分,每对引物的信息,双击选中一对引物,第四步，选择引物搜索的结果,第五步.检测软件设计的引物,是否出现引物自身发夹结构，二聚体，错配位点等,上游引物搜索结果,下游引物搜索结果,第六步，获取引物信息,引物及产物信息,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有,引物设计软件小结,PCRDESIGN（分析评价引物的功能，简单方便）Oligo6.0（分析评价引物功能，最优秀）PrimerPremier5.0（自助搜索引物的功能）,Oligo6.0与PrimerPremier5.0搭配使用，可快速设计出成功率高的引物。,引物特异性检测,设计PCR引物后，需要对引物的特异性进行检测。检测引物是否能与基因组或cDNA数据库中其他位置结合，扩增出非特异性条带。,PrimerBlast,Primer-BLAST可以直接从Blast主页进入：（/）PrimerBlast也可以直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/,提交的界面主要包括三个部分：targettemplate（模板区）,theprimers（引物区）,和specificitycheck（特异性验证区）,1.在“PCRTemplate”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用AccessionNumber。,输入验证引物,根据需要设置外显子与内含子选项,在specificitycheck区：4种数据库：RefSeqmRNA,Genome(selectedreferenceassemblies),Genome,andnr；多个物种（人，鼠）。,Primer-blast软件检测结果,检测结果显示：HMGB2基因虽然有相似区，但是3端没有完全互补，因此该引物只能特异性地扩增HMGB1基因，不能扩增出HMGB2基因。,Primer-blast软件检测结果,下午,序列查找及引物的设计,教师指导下，学生自主读取基因的序列，设计引物（13：30-15：00）,根据不同的实验目的设计引物，比如全长，部分,总结自己所遇到的问题及解决方法，与他人分享,ThemRNAsequenceofHomosapiensinterferon,alpha1isasfollowed:,1agaacctagagcccaaggttcagagtcacccatctcagcaagcccagaagtatctgcaat61atctacgatggcctcgccctttgctttactgatggtcctggtggtgctcagctgcaagtc121aagctgctctctgggctgtgatctccctgagacccacagcctggataacaggaggacctt181gatgctcctggcacaaatgagcagaatctctccttcctcctgtctgatggacagacatga241ctttggatttccccaggaggagtttgatggcaaccagttccagaaggctccagccatctc301tgtcctccatgagctgatccagcagatcttcaacctctttaccacaaaagattcatctgc361tgcttgggatgaggacctcctagacaaattctgcaccgaactctaccagcagctgaatga421cttggaagcctgtgtgatgcaggaggagagggtgggagaaactcccctgatgaatgcgga481ctccatcttggctgtgaagaaatacttccgaagaatcactctctatctgacagagaagaa541atacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatccctctctttatc601aacaaacttgcaagaaagattaaggaggaaggaataacatctggtccaacatgaaaacaa661ttcttattgactcatacaccaggtcacgctttcatgaattctgtcatttcaaagactctc721acccctgctataactatgaccatgctgataaactgatttatctatttaaatatttattta781actattcataagatttaaattatttttgttcatataacgtcatgtgcacctttacactgt841ggttagtgtaataaaacatgttccttatatttactc,测试题1.请设计一对引物，扩增IFN-alpha1的部分序列，用于IFN-alpha1基因的检测。,Group1,ThemRNAsequenceofHomosapiensinterleukin4isasfollowed:,1ttctatgcaaagcaaaaagccagcagcagccccaagctgataagattaatctaaagagca61aattatggtgtaatttcctatgctgaaactttgtagttaattttttaaaaaggtttcatt121ttcctattggtctgatttcacaggaacattttacctgtttgtgaggcattttttctcctg181gaagagaggtgctgattggccccaagtgactgacaatctggtgtaacgaaaatttccaat241gtaaactcattttccctcggtttcagcaattttaaatctatatatagagatatctttgtc301agcattgcatcgttagcttctcctgataaactaattgcctcacattgtcactgcaaatcg361acacctattaatgggtctcacctcccaactgcttccccctctgttcttcctgctagcatg421tgccggcaactttgtccacggacacaagtgcgatatcaccttacaggagatcatcaaaac481tttgaacagcctcacagagcagaagaacacaactgagaaggaaaccttctgcagggctgc541gactgtgctccggcagttctacagccaccatgagaaggacactcgctgcctgggtgcgac601tgcacagcagttccacaggcacaagcagctgatccgattcctgaaacggctcgacaggaa661cctctggggcctggcgggcttgaattcctgtcctgtgaaggaagccaaccagagtacgtt721ggaaaacttcttggaaaggctaaagacgatcatgagagagaaatattcaaagtgttcgag781ctgaatattttaatttatgagtttttgatagctttattttttaagtatttatatatttat841aactcatcataaaataaagtatatatagaatct,Group2,测试题2.请设计一对引物，扩增IL-4的部分序列，用于IL-4基因的检测。,测试题3.请设计一对引物，扩增IFN-alpha5的部分序列，用于IFN-alpha5基因的检测。,ThemRNAsequenceofHomosapiensinterferon,alpha5isasfollowed:,1gcccaaggttcagggtcactcaatctcaacagcccagaagcatctgcaacctccccaatg61gccttgccctttgttttactgatggccctggtggtgctcaactgcaagtcaatctgttct121ctgggctgtgatctgcctcagacccacagcctgagtaacaggaggactttgatgataatg181gcacaaatgggaagaatctctcctttctcctgcctgaaggacagacatgactttggattt241cctcaggaggagtttgatggcaaccagttccagaaggctcaagccatctctg