7.2 毛细管电泳法

,毛细管电泳法CapillaryElectrophoresis,CE,毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。,20世纪3040年代蒂塞利乌斯(A.W.K.Tiselius）建立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术获得1948年诺贝尔化学奖,1981年J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分析方法。,主要内容,毛细管电泳的原理分离模式进样与检测毛细管电泳的应用,一毛细管电泳的原理,1装置毛细管数据处理电极检测器电极试样缓冲液缓冲液高压电源（可高至30KV）,2电泳和电渗,电泳是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。电渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。,2电泳和电渗,电泳行为与特性使用淌度描述即单位场强(E)下离子的平均电泳速度ep=/E实验中，只发生电泳时有效淌度ef=ef(L/V)=(l/tm)(L/V)毛细管有效长度迁移时间毛细管总长度电压,电渗与固液界面的双电层有着密切的关系在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（electroosmoticflow,EOF）。,2电泳和电渗,固液两相间的总电势-热力学电势-0,Zeta电势-,电渗流的流型特点电渗流HPLC塞流层流,2电泳和电渗,电渗流的表示电渗流的大小可用淌度(eo)或电渗流系数表示eo=eo/E=l/(teoE)电渗流速度毛细管有效长度电渗流流出时间电场强度,2电泳和电渗,电渗流的意义电泳过程中，伴随着电渗现象电渗流的速度比电泳速度快57倍利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析电渗流是毛细管电泳分离的重要参数控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。,分情况而论,2电泳和电渗,改变电渗流的方法改变外加径向电场改变缓冲液成分和浓度Zeta电势改变缓冲液pH加入添加剂改变温度粘度,盐-离子强度,表面活性剂,eo正比于Zeta电势和介质的介电常数反比于介质的黏度Zeta电势正比于双电层厚度和界面有效电荷密度反比于介质的介电常数,2电泳和电渗,表观电泳淌度ap,ap=ap/Eap为离子的表观迁移速度ap=ef+eoap=ef+eo,2电泳和电渗,3分离效率和分离度,分离效率柱效可以用理论塔板数n表示n=(ep+eo)Vl/(2DL)毛细管电泳分离的柱效方程理论塔板高H=L/nn=5.54(/W)2实验上可按上式求出理论塔板数为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离W为电泳峰的半高峰宽,分离度电泳中两峰的分离度（Rs），也称为分辨率，它表示了淌度相近的组分分开的能力，可表达为Rs=（n1/2/4）（/平）相邻两区带的迁移速度差平为两者的平均速度/平表示分离选择性n为柱效,3分离效率和分离度,分离度计算式Rs=2(tm2-tm1)/(W1+W2)tm1、tm2分别为两个组份的迁移时间W为峰底的宽度,3分离效率和分离度,4区带宽度及其展宽因素,区带宽度Ws=（Wtl/tm）-Wd,时间宽度,检测器的窗口宽度,空间宽度,区带宽度展宽因素焦耳热进样电泳扩散毛细管壁对组分的吸附,4区带宽度及其展宽因素,焦耳热细内径（100m），粗外径的毛细管柱,温度轮廓-黏度轮廓-速度轮廓,4区带宽度及其展宽因素,进样试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。一般进样区带控制在柱长的1%电泳扩散试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。s-b,峰前展或拖尾？,4区带宽度及其展宽因素,毛细管壁对组分的吸附电泳峰拖尾或变形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：使用极端pH条件加入中性盐或两性离子化合物对毛细管内壁进行涂层处理需要注意：方法也会抑制或改变电渗流,4区带宽度及其展宽因素,二分离模式,1毛细管区带电泳2胶束电动色谱3毛细管凝胶电泳4毛细管等速电泳5毛细管等电聚焦6毛细管电色谱,1毛细管区带电泳,CZE也称为毛细管自由溶液区带电泳毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其它各种操作模式的母体,2胶束电动色谱,电动色谱:是以电渗流驱动的一种色谱技术胶束电动色谱MEKC:是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合,加入高于胶束临界浓度的表面活性剂,胶束电动色谱的应用特点:使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离中性化合物.比高效液相色谱更为高效.HPLC分离柱效为500025000理论板数/mMEKC可达到50000500000理论板数/m比高效液相色谱更为高速.MEKC分离时间通常小于30min，但达到相仿效率的毛细管LC，需要更长的时间。,2胶束电动色谱,3毛细管凝胶电泳,CGE是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的大小分离,毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点:电泳峰尖锐，柱效极高短柱上实现极好的分离试样容量为1012g主要缺点:制备柱较困难，寿命较短已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核酸、DNA等强有力的工具。例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合，用于DNA序列快速分析。,3毛细管凝胶电泳,4毛细管等速电泳,分离是建立在试样中各组分的电泳淌度不同，等速电泳中被分析试样进样前后分别使用前导电解质溶液和终结电解质溶液，分离后的各组分区带以相同的电泳迁移速度通过检测窗口。,4毛细管等速电泳,注意:前导电解质的电泳淌度应高于试样中各组分的电泳淌度，而终结电解质的电泳淌度则反之。电泳过程中被分离各组分的浓度都将接近前导电解质浓度，对痕量组分在柱上浓缩可达几个数量级，成为重要的柱上浓缩技术之一。,4毛细管等速电泳,5毛细管等电聚焦,CIEF:建立在不同蛋白质或多肽之间等电点（pI值）差异基础上的分离方法。蛋白质的等电点(pI):指蛋白质分子的表观电荷数为零时的pH值。,方法:进样等电聚焦检测先将脱盐的试样（蛋白质）以1的浓度与两性电解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)，置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如NaOH中。施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管内很窄的不同pH区域内聚焦.在阳、阴极电解液中加入盐如NaCI或NaOH,破坏pH梯度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。,5毛细管等电聚焦,特点:等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这一过程可用于浓缩试样组分。具有极高的分辩率，可以分离等电点相差0.01pH的两种蛋白质.注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定,5毛细管等电聚焦,6毛细管电色谱,CEC:以电渗流驱动流动相，开管和填充两种比高效液相色谱具有更高的柱效,三进样与检测,1进样方法电动进样也称电迁移进样.方法:将毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中，试样管中插入电极，与检测端的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间，试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管，然后再将试样溶液换成载体缓冲液，电泳即可进行。,1进样方法,流体动力学进样也称为虹吸进样、重力进样、压差进样方法:毛细管进样端插入试样溶液容器，通过进样端加压，或检测端出口减压，或调节进样端试样溶液液面大于出口端缓冲液液面高度，利用虹吸现象，使进样口端与出口端形成正压差，并维持一定时间，试样在压差作用下进入毛细管进样端，再把进样端放回缓冲液液槽中，进行电泳,2检测方法,紫外吸收检测器,2检测方法,检测器检出限（mol/L）特点UV可见吸收10-510-6近似通用，常规应用荧光非相干光诱导10-710-8灵敏，但试样通常要衍生激光诱导10-