HPLC方法开发——流动相的选择

.,HPLC方法开发流动相的选择,.,1.流动相的一般要求,流动相对样品具有一定的溶解能力流动相具有一定惰性流动相应不改变填料的任何性质纯度高流动相的黏度要尽量小流动相的物化性质要与使用的检测器相适应流动相沸点不要太低应选用挥发性溶剂流动相配置好后要进行过滤流动相配制好后要进行脱气,.,2.常用溶剂的重要性质,极性黏度沸点紫外截止波长,.,常用溶剂参数表,.,3.过滤,溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。,.,4.脱气,氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min。在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气。,.,5.溶剂过滤器的防护,溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。（1）严格执行溶剂过滤（2）勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液（3）避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用蒸馏水冲洗干净。,.,6流动相的贮存,流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器内，不要贮存在塑料容器中。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧及尘埃溶入流动相。磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存超过规定的有效期。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。,.,7HPLC实验用水,HPLC实验用水除满足药典对纯化水一般要求外，还需要满足以下要求：,HPLC级水增加紫外加吸收要求：在1cm池中，用HPLC级水作空白，在190nm、200nm和250400nm的吸收度分别不得过0.01、0.01和0.05。,.,8.等度洗脱,在反相色谱中，极性越强的溶剂洗脱能力越弱。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，组分极性有一定差别的样品，多用于含量测定。优点：基线平稳，保留时间重现性好，对流动相纯度要求低。缺点：较早洗脱出的色谱峰时分离度差，较晚洗脱出的色谱峰展宽理论塔板数低。,.,9.梯度洗脱,梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多样品。,优点：缩短分析时间提高分离度改善峰形提高检测灵敏度,缺点：增加基线漂移较长平衡时间,.,9.梯度洗脱,在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。每次梯度洗脱之后必须1030倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使其恢复到初始状态。,.,10流动相的pH值,反相离子抑制技术：采用反相色谱法分离弱酸或弱碱样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的解离平衡常数Ka值越小，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，流动相的pH值越大，组分的Ka值越大，当pH值远远大于弱碱的pKa值时，弱碱主要以分子形式存在；分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用1050mmol/L磷酸盐缓冲液，0.05%TFA；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用10mmol/L三乙胺溶液，0.050.5%NH4OH。,.,10流动相的pH值,当溶液pH值等于化合物的pKa时，化合物半解离。在pKa1.5的范围内，保留随pH值的变化而发生明显变化。超过此pH值范围，化合物完全解离或不解离，保留随pH值的变化很小。了解化合物的pKa值，可在pKa2的范围外调节流动相的pH值，使化合物有较好的峰形，保持保留的恒定，使建立的方法具有耐用性。,.,10流动相的pH值,.,11.缓冲盐,HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。清洗液配制:90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，因此此时应该在进液口位于混合器下方放置含盐流动相进液口位于混合器上方放置不含盐流动相；,.,11.缓冲盐,.,12.离子对试剂,作用原理：离子对试剂与待分析的物质（多为在溶液状态时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性，这样非极性就表现出来，从而在色谱柱上有保留行为。试剂选择：分析酸性（作用基团）样品一般用阳离子对试剂（四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵），分析碱性样品用阴离子对试剂（己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠十二烷基磺酸钠）离子对的分离机制-离子对模型样品离子首先在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的疏水性离子对，然后溶解或吸附于非极性固定相上。离子对试剂的烷基C链越长，生成的离子对与固定相的亲和力越大，因此组分的保留值也越大。使用离子对试剂浓度尽可能的低（一般0.005mol/L)，以保证对柱子填料的稳定性影响最小及清洗方便。,.,12.离子对试剂,离子对试剂使用注意的因素有：1、离子对的浓度，这个一般情况下在满足要求的前提下越低越好。2、离子对溶液的pH，这个是进行分离的最关键的因素，而只能在缓冲液中测定pH,不要混合有机相后测定。3、如果使用离子对试剂，一定注意平衡时间，正常的话在60-90分钟才能达到彻底的平衡，还有在实验结束以后要冲洗超过2个小时，否则柱子可能会不可逆的损伤。4、用离子对进行实验所用的柱子尽量和其他的非离子对的分开使用。,.,13.各种检测器对流动相的特殊要求,13.1UV：截止波长:将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A1时的波长。中国药典对UV法溶剂的要求是：以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度：在220240nm范围内不得超过0.40在241250nm范围内不得过0.20在251300nm范围内不得过0.10在300nm以上不得过0.05,.,13.各种检测器对流动相的特殊要求,13.2ELSDELSD对流动相的组成不敏感，可以用于梯度洗脱；ELSD要求流动相要蒸发掉，因此不能使用不易挥发的物质来调节流动相的pH值。,.,13.各种检测器对流动相的特殊要求,13.3MSD由于盐对质谱的损伤很大，故在流动相的选择上，需避免使用不可挥发性盐，尽