基因工程的基本工具

乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),转基因抗虫棉,抗虫棉,普通棉,专题一基因工程,DNA重组技术的基本工具,基因工程的概念,基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程的概念,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与载体DNA拼接导入,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与载体DNA连接,关键步骤三：,抗虫基因导入受体(棉花)细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：,基因的剪刀限制酶基因的针线DNA连接酶基因的运载工具载体,DNA重组技术的基本工具,本节知识内容,1DNA重组技术的基本工具,专题一基因工程,“分子手术刀”限制酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,限制性内切酶作用过程,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。,4000种。,形成两种末端,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,EcoRI,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,限制酶,什么叫黏性末端？,限制酶,什么叫黏性末端？,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,二、“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：2、作用部位：,两类,磷酸二酯键,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,DNA连接酶的作用过程,3、区别：E.coliDNA连接酶连接黏性末端T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又可以连接平末端（效率低）,T,磷酸二酯键,A,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？,（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,三、“分子运输车”基因进入受体细胞的载体：,外源基因(胰岛素基因)怎样才能导入受体细胞(大肠杆菌)？,导入过程需要运输工具载体。,载体的作用有哪些？,作用一：作为运载工具，将外源基因(胰岛素基因)转移到受体细胞(大肠杆菌)中去。作用二：利用载体在受体细胞(大肠杆菌)内，对外源基因(胰岛素基因)进行大量复制。,作为载体必须具备哪些条件？,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,常用的载体主要有两类：1）细菌细胞质的质粒2）噬菌体或某些动植物病毒,基因工程的“专用工具”,运载体：常用质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒质粒特点：,1、细菌拟核外双链环状DNA分子2、能自我复制并在受体细胞中稳定存在3、有一个或多个限制酶切点4、有特殊的标记基因,练习答案,2和7能连接形成ACGTTGCA；4和8能连接形成GAATTCCTTAAG；3和6能连接形成GCGCCGCG；1和5能连接形成CTGCAGGACGTC。,迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵,基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,课本知识回顾,基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，改造生物的遗传性状。,基因拼接技术,DNA重组技术,基因,修饰改造,定向地,DNA重组技术的基本工具,“分子手术刀”,“分子缝合针”,“分子运输车”,限制酶,DNA连接酶,基因进入受体细胞的载体,限制性核酸内切酶,主要是从的一种酶。识别双链DNA分子的某种，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开。形成两种末端,原核生物中分离纯化出来,特定的核苷酸