DB21∕T 2149-2013 水产育苗用盐生杜氏藻培养技术.doc

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号DB21辽宁省地方标准DB 21/ TXXXX水产育苗用盐生杜氏藻培养技术Culture techniques of Dunaliella salina for aquaculture breeding 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：2012-12-12）XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/ TXXXX前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准由辽宁省海洋与渔业厅归口。本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：李华琳、王笑月、李文姬、陈冲、王庆志。本标准附录A、B为资料性附录。本标准首次发布。7水产育苗用盐生杜氏藻培养技术1 范围本标准规定了水产育苗用盐生杜氏藻(Dunaliella salina)培养的术语和定义、水质条件和设施设备、消毒方法、培养液的配制、藻种提纯与培养、生产性培养及收获等。本标准适用于盐生杜氏藻培养。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 11607 渔业水质标准GB 19106 次氯酸钠溶液GB 26373 乙醇消毒剂卫生标准GB 26369 季铵盐类消毒剂卫生标准NY 5052 无公害食品 海水养殖用水水质NY 5071 无公害食品 渔用药物使用准则SC/T 1059 渔用含氯消毒剂3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 盐生杜氏藻(Dunaliella salina)属绿藻门（Chlorophyta）、绿藻纲（Chlorophyceae）、团藻目（Volvocales）、盐藻科（Dunaliellaceae）、杜氏藻属（Dunaliella）。藻体单细胞，无细胞壁，通常为梨形、椭圆形，前端2条等长的鞭毛比细胞长1/3，无性繁殖。主要生存于海水、咸水湖。3.2 藻种具有良好的特征性状，细胞活跃，新鲜无污染的单种藻。3.3 接种在无污染条件下，将合格藻种接入到培养液中的操作过程。3.4 封闭式培养藻种在封闭透明的容器中培养。除了充气管、加液管和藻液抽出管外，不与外界接触。3.5 开放式培养藻种在敞开的容器中培养。3.6 一次性培养藻种在定量培养液中生长繁殖达到指数生长期时，一次性全部收获或全部用于下一级接种培养。3.7 次氯酸钠溶液有效氯 指次氯酸钠加酸后放出氯的量，是次氯酸的有效成分。按照GB 19106 测定。4 水质条件和设施设备4.1 水质条件水源水质应符合GB 11607和NY 5052规定，培养用水经过沉淀、过滤、消毒后使用。4.2 设施设备4.2.1 藻种间培养藻种的房间，光线应充足、通风条件好。配有控温、调光和培养设施。4.2.2 培养间生产性培养车间，光线应充足、通风条件好。配有培养池、处理水池、输水、控温、调光设施。培养池容积5m320m3，深度0.8m1.0m的水泥池或其他容器，配有搅拌耙。处理水池与培养池容积比1：10。4.2.3 操作间用于器具清洗消毒、海水加热消毒、培养液配制及藻液质量检查等操作的房间。配有清洗水槽、消毒盆、电炉、工作台、显微镜、天平、量筒、试剂柜和化学试剂等。4.2.4 配套设施应具备供电系统、供水系统、控温系统、海水沉淀砂滤处理设施等。5 消毒方法5.1 培养用海水消毒5.1.1 加热消毒加热至100沸腾3min5min，冷却至室温备用。5.1.2 次氯酸钠溶液消毒按含有效氯20mg/m340mg/m3，加入次氯酸钠溶液处理时间应12h，然后按25g/m355g/m3 加入硫代硫酸钠还原，强充气1h后，用碘化钾淀粉试剂（见附录A）或碘化钾淀粉试纸测试无余氯后才可使用。硫代硫酸钠实际用量随次氯酸钠有效氯的变化而适量增减。含氯消毒剂使用应符合SC/T 1059的规定。5.2 培养用器具消5.2.1 煮沸消毒 刻度吸管、筛绢放入加热容器中，加水煮沸10 min15min。 三角烧瓶注入适量水，置于电炉上煮沸10min，消毒完毕用无菌纸包扎瓶口。5.2.2 烘箱干燥消毒培养皿、试管等小型玻璃器皿用清水洗净后，均匀放入烘箱，加热到180维持1h。5.2.3 乙醇消毒温度计、天平、药匙等用70%75%乙醇涂擦表面2遍。乙醇消毒剂使用应符合GB 26373的规定。5.2.4 次氯酸钠溶液消毒 二级培养容器、搅拌耙等用含有效氯0.1%的次氯酸钠溶液浸泡12h消毒。 水泵、水管用含有效氯0.1%的次氯酸钠溶液循环15min，停留12h消毒。5.2.5 苯扎溴铵溶液消毒操作台、培养架用0.1%苯扎溴铵溶液擦拭消毒。季铵盐类消毒剂使用应符合GB 26369的规定。5.3 培养池消毒培养池在接种前, 用含有效氯1%的次氯酸钠溶液均匀地涂洗池壁、池底及搅拌耙2遍，消毒2h后，再用还原好的海水冲洗后使用。也可用次氯酸钠消毒的海水直接浸泡12h后中和使用。6 培养液的配制6.1 藻种培养液配制按附录B表A.1康威液营养盐标准溶液配方配成母液，遮光冷藏备用；使用时按每升消毒海水添加1mL甲液和0.1ml丙液配成藻种培养液。配制过程中每个环节操作应认真消毒。化学试剂应达到化学纯；药品使用符合NY 5071规定。6.2 生产用培养液配制按附录B表A.2配方直接称量配制，试剂应达到工业级。7 藻种提纯与培养7.1 藻种提纯将稀释的盐生杜氏藻藻液用划线法接种到无菌固体培养基表面，按7.2.1条件培养10d20d，选具有纯种特征、独立、无污染的藻落，用接种针将其挑入适量培养液中培养。每年至少一次。7.2 藻种培养7.2.1 条件温度2229,pH7.08.5，光照强度1000lx5000lx，盐度3045。 7.2.2 培养方式封闭式培养。7.2.3 培养方法 一级培养：按5.1.1方法消毒海水，将藻种与藻种培养液按1:11:5比例接种于5000ml三角烧瓶中，按7.2.1条件经5d15d的培养，藻液颜色较深、密度较大时应添加新的培养液培养；满瓶的应及时分瓶培养。 二级培养：按5.1.1方法消毒海水，将藻种与藻种培养液按1:31:8比例接种于聚乙烯桶或其它大型透明容器中，按7.2.1条件一次性培养。7.2.4 日常管理7.2.4.1 搅拌充气每天3次4次摇动培养瓶。7.2.4.2 调节光照根据天气情况采用布帘、人工光源等调节藻种间光照度，保持适宜光照；经常调换强、弱光照区的藻种位置。7.2.4.3 温度控制利用空调等控温设施,将藻种间温度保持在适宜范围。7.2.4.4 调节酸碱度对生长特别旺盛的pH偏高藻种用盐酸溶液（盐酸与水比例1:10）滴入培养液中，降低pH至适宜范围。7.2.4.5 观察处理日常观察藻液呈现的颜色，正常的藻液应沉淀较少、颜色每日变深。如有附壁、沉淀应及时调整温度、光照、pH值，保持适宜条件，并增加摇瓶搅拌次数；显微镜检查藻液发现敌害生物或混种应弃之。7.2.4.6 记录记录日常操作、观察处理结果等情况。8 生产性培养8.1 培养方式开放式培养。8.2 培养方法 按5.1.2方法消毒海水。 按5.3方法消毒培养池，并将处理好的海水注入消毒好的培养池。 按6.2方法配制培养液。 藻种与培养液按1:31:10比例接种于培养池中培养。 接种宜在上午进行，提前于预计投喂时间10d15d。 按7.2.1条件一次性培养。8.3 日常管理8.3.1 搅拌充气用专用搅拌耙每天搅动藻液3次4次。避免藻液溅入邻池。8.3.2 调解光照根据天气情况调节培养间的照度，阴雨天可增加人工光源。8.3.3 温度控制定时监测藻液温度，利用加热设备、开窗通风等方法调节温度。8.3.4 观察处理每天观察藻液颜色及状态，如有附壁应及时调整温度、光照、pH值，保持适宜条件，并增加搅池次数。显微镜检查发现敌害生物污染严重的藻液应放弃培养，重新接种。8.3.5 记录记录日常操作、观察处理结果等情况。8.4 敌害生物的防治 对敌害生物应以防为主，严格培养过程中每个环节操作，认真消毒，杜绝人为操作污染。 提高接种比例，以数量优势保持藻类生长优势。 有少量原生动物污染可采用提高盐度至6070培养解决。9 收获 达到水产育苗所要求的密度和质量,可以直接投喂；宜选择10d以内的新鲜藻液，密度80104cell/ml。A附录A （资料性附录）碘化钾淀粉试剂的配制与余氯检测方法试剂配制：称取1g淀粉至200mL蒸馏水或纯净水中，加热并不断搅拌至液体澄清，冷却后加入2g碘化钾摇匀。此试剂应避光低温保存。余氯检测：取被检测海水10mL50mL，滴入几滴碘化钾淀粉试剂，若被检测海水不变色，则无余氯；若被检测海水变蓝色，则有余氯。BA附录B （资料性附录）水产育苗用盐生杜氏藻培养液配方表A.1 康威液营养盐标准溶液配方甲液成 份用 量FeCl3.6H2O2.60gMnCl2.4H2O0.72gH3BO367.20gEDTA90.00gkH2PO4（或Na2H2PO4.2H2O）40.00gNaNO3200.00g乙液20ml蒸馏水（淡水煮沸）加至2000ml使用时1000ml消毒海水加1ml甲液乙液ZnCl22.1gCoCl2.6H2O2.0g（NH4）6M