基于新一代测序的表观遗传学研究

基于新一代测序的表观遗传学研究 No.G012-1308 表 观 遗 基于新一代测序的表观遗传学研究 传 学 研究目的 DNA 甲基化是表观遗传学研究的重点，是基因调控的 通过酶切富集启动子及 CpG 岛区域，并进行 Bisulfite 测序， 手段之一，在维持细胞正常功能、传递基因组印记、胚胎发育 同时实现 DNA 甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高 和肿瘤发生等方面起着至关重要的作用。基于不同的新一代 利用率。研究者进行了全基因组甲基化测序（BS）和 RRBS 测序研究方案，检测表观遗传学变异尤其是基因组的甲基 的比较，发现 RRBS 在启动子，CpG 岛区域具有更高的覆盖 化，探讨甲基化对于生物学功能的影响，并筛选可应用作为 倍数 如图 1 所示），并且 RRBS 和 BS 具有很好的相关性（如 疾病早期诊断、分级和分型的分子标记。 图 2 所示）。RRBS 可作为一种更高效经济的研究方法，在大 规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。 研究对象和取材 研究对象：各类肿瘤、发育、干细胞分化的不同阶段。 取样标准：肿瘤组织与正常组织有明显区别，组织病理 切片分析肿瘤样品中肿瘤细胞的比例在 80% 以上；正常样 品中几乎不含有肿瘤细胞，或以血液作为正常对照。 新一代测序方案 RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）基于 Msp| 酶切消化和 bisulfite 处理的高性 价比方法，可对基因组 promoter 区及 CpG 岛区域的 DNA 甲基化状态进行样品之间的比较分析。 图 1. RRBS 和 BS 在 CpG 岛平均覆盖深度的比较，其中 RRBS 的测 MBD-Seq（Methylated DNA Binding Domain 序 数 据 为 6G，BS 的 测 序 数 据 是 103.5G。（Wang L, et al . J Sequencing）由于在哺乳动物中甲基化一般发生在 CpG Biotechnol. 2012） 的胞嘧啶 5 位碳原子上，所以可通过特异性结合甲基化 DNA 的蛋白 MBD2b 富集高甲基化的 DNA 片段，并结合 第二代高通量测序，对富集到的 DNA 片段进行测序，从而 检测全基因组范围内的甲基化位点。 M e D I P - S e q （ M e t h y l a t e d D N A Immunoprecipitation Sequencing ）通过使用 5 - 甲 基胞嘧啶抗体富集高甲基化的 DNA 片段，然后将富集后的 DNA 进行高通量测序。 BS（Bisulfite Sequsencing）Bisulfite 处理能够将 基因组中未甲基化的 C 碱基与甲基化的 C 碱基区分开来， 因此成为表观遗传学研究的经典实验方法。将 Bisulfite 处理 与高通量测序技术的结合的 Bisulfite Sequencing 能够绘 制单碱基分辨率的 DNA 甲基化图谱，可用于研究特定 图2 . R R B S 和 B S 甲 基 化 水 平 的 相 关 性 分 析 。 （ W a n g L , e t a l . J DNA 区域甲基化与特定表型之间的关联。 iotechnol. 2012） 案例解读 案例（二）运用ERRBS甲基化测序研究前 列腺癌 案例（一）RRBS作为一种高性价比的甲基 化研究方法，在大规模临床样本的研究中具 研 究 者 通 过 Enhanced Reduced Representation BisulfiteSequencing（ERRBS）对 7 个局限性前列腺癌 有广泛的应用前景 PCa 组织样本，7 个对应的良性前列腺 Ben 组织样本，6 RRBS 是一种准确、高效、经济的 DNA 甲基化研究方 个去势抵抗前列腺癌 CRPC 组织样本进行了高通量测序。 法，通过酶切富集启动子及 CpG 岛区域进行 Bisulfite 测序， 通过对三组样本的分析，发现甲基化程度随着疾病严重程度 No.G012-1308 的增加而增加，进一步的研究发现大部分的 PCa 甲基化改 学 变发生在等位基因特异甲基化区域。 传 遗 观 A l a v i 表 v r u s l l a r e v O Days Days 图4. HIST1H3C 和GNAS的甲基化水平和总生存率以及无事件存活率 的相关性分析。U代表未甲基化的病例，M代表甲基化的病例。 （Decock A, et al. Genome Biol. 2012） 案例（四）通过MeDIP-seq检测急性髓细 B 胞白血病特有的甲基化区域 研究者通过对 12 个急性髓细胞白血病（AML）病人和 4 个正常人的骨髓进行了 MeDIP-seq。通过聚类分析，找 到 了 AML 的 特 有 的 甲 基 化 区 域。进 一 步 的 研 究 发 现， SPHKAP, DPP6, ID4 这三个基因在 AML 中表达量很低， 用去甲基化的药物处理后，这些基因的表达量都有不同程度 的升高。 A.1 B.1 C.1 图3. DNA甲基化程度随疾病严重程度增加而增加。A. 三组样本 CpG岛 和非CpG岛区域的DNA甲基化程度 B. 韦恩图显示从Ben到PCa SPHKAP DPP6 ID4 和从PCa到CRPC的甲基化程度增加的CpG岛区域的交集。（Lin PC, et al. Neoplasia. 72013） 案例（三）运用MBD-seq检测神经母细胞 瘤预后甲基化生物标志 A.2 B.2 C.3 研究者通过 methyl-CpG-binding domain MBD-seq SPHKAP DPP6 ID4 方法，对 8 个神经母细胞瘤细胞系进行了高通量测序。通过 高通量测序，初步筛查到了 43 个候选的生物标记。后期研究 者又通过在 89 个初级神经母细胞瘤样本中进行进一步的 PCR 验证，最后筛查出了 HIST1H3C 和 GNAS 的甲基化 图5. SPHKAP, DPP6 和ID4 在AML中的表达量。 A.1, B.1, C.1 分别 水平和总生存率以及无事件存活率相关，如图 4 所示。 表SPHKAP, DPP6, ID4 在AML和正常组织中的表达水平 A.2,B.2, C. 2 分别代表SPHKAP, DPP6, ID4在 OCI-AML2和CTS细胞系 用DAC处理前后的表达水平。（Saied MH, et al. PLoS One. 2012） 参考文献 1. Wang L, Sun J, Wu H, et al. Systematic assessment of reduced representation bisulfite sequ encing to human blood samples: A promising method for large- sample-scale epigenomic studies. J Biotechnol. 2012; 157 1 : 1- 6. 2. Lin PC, Giannopoulou EG, Park K, et al. Epigenomic alterations in localized and advanced prostate cancer. Neoplasia. 2013; 15 4 : 373- 83. 3. Decock A, Ongenaert M, Hoebeeck J, et al. Genome-wide promoter methylation analysis in neuroblastoma identifies prognostic methylation biomarkers. Genome Biol. 2012; 13 10 : R95. 4. Saied MH, Marzec J, Khalid S, et al. Genome wide analysis of acute myeloid leukemia reveal leukemia specific methylome and subtype specific hypomethylation of repeats. PLoS One. 2012; 7 3 : e33213. GUANGZ