原核基因表达调控

第六章原核生物基因表达的调控,6.1乳糖操纵元lactoseoperon6.2色氨酸操纵元6.3基因转录的时序调控6.4小分子RNA的翻译调节,引言,一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。这种“开-关”（on-off）活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA的合成是可以被调节的。当我们说一个系统处于“off”状态时，也有本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞只合成1或2个mRNA分子。所谓“关”实际的意思是基因表达量特别低，很难甚至无法检测。科学家把这个从DNA到蛋白质的过程称为基因表达(geneexpression)，对这个过程的调节就称为基因表达调控(generegulation或genecontrol)。要了解动、植物生长发育的规律、形态结构特征和生物学功能，就必须弄清楚基因表达调控的时间和空间概念，掌握了基因表达调控的秘密，我们手中就有了一把揭示生物学奥妙的金钥匙。,基因表达调控主要表现在以下几个方面：转录水平上的调控(transcriptionalregulation)；mRNA加工成熟水平上的调控(differentialprocessingofRNAtranscript)；翻译水平上的调控(differentialtranslationofmRNA).原核生物中，营养状况(nutritionalstatus)和环境因素(environmentalfactor)对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormonelevel)和发育阶段(developmentalstage)是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。,6.1.1DiscoveryofOperon1961年,F.Jacob&J.Monod提出,此后不断完善。获1965年诺贝尔生理学和医学奖1940年，Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线”。文献：细胞中存在两种酶，即组成酶与诱导酶1947年，报告：“酶的适应现象及其在细胞分化中的意义”,6.1乳糖操纵元,1951年，Monod与Jacob合作，发现两对基因：Z基因：与合成-半乳糖苷酶有关；I基因：决定细胞对诱导物的反应。Szilard：I基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存在时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能去掉该阻遏物。Jacob：结构基因旁有开关基因（操纵基因），阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因的表达。,乳糖操纵元结构,调节基因,操纵元是一种完整的具有特定功能的细菌基因表达和调节的单位，包括调节基因，操纵位点，结构基因，组成一个控制单元结构基因：产生mRNA,合成蛋白质操纵位点promotor,operator：启动子结合位点调节基因：产生调节蛋白（与操纵位点结合）结构基因不转录诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合结构基因转录,6.1.2酶的诱导现象,-半乳糖苷酶,分解底物的酶只有在底物存在时才出现！,无乳糖时，几个-gal/cell加入乳糖时，5000个再去掉乳糖，-galmRNA下降乳糖能激发-galmRNA的合成乳糖的诱导作用是由酶前体转化而来，还是诱导新酶合成？培养基（35S-aa,无乳糖）E.coli繁殖培养基（无35S-aa,加入乳糖）-gal(无35S),6.1.3调控机理,1调控区结构lacI,1045bp，独立PiP,82bp，821O,35bp，728lacZYA,体外结合竞争实验:阻遏物RNApol,offRNApol阻遏物，on,2.阻遏状态,3诱导状态,诱导物,诱导作用：在可诱导的操纵元中，加入对基因表达有调节作用的小分子后，开启基因的转录活性,4诱导物不是乳糖,生成lac诱导物,乳糖代谢,Allolctose异构乳糖别乳糖,细胞内-半乳糖苷酶来源?,gratuitousinducer安慰诱导物义务诱导物,可诱导半乳糖苷酶产生，但不是其底物IPTG，异丙基半乳糖苷TMG，巯甲基半乳糖苷ONPG,O-硝基半乳糖苷,在研究诱导作用时，很少使用乳糖,6.1.4阻遏蛋白的作用机制,1阻遏蛋白结构38KD，4聚体，一个亚基结合一个IPTG分子lacI组成型转录Pi弱启动子，510个cell具有二重性阻止转录（与lacO结合）开始转录（与诱导物结合）,阻遏蛋白的结构域,头段，-NH2端，lacO结合区绞链区核心段，-COOH，诱导物结合区,4个亚基的核心片段接触形成四聚体,对称轴，+11对称序列，6bp,阻遏蛋白的结合位点lacO的结构,3阻遏蛋白对RNApol功能的影响,阻遏蛋白和RNApol可同时与DNA结合RNApol与启动子结合的平衡常数1.9X107有阻遏蛋白时,2.5X109结合着的RNApol不能转录.但加入诱导物后,释放出阻遏蛋白,变为开放型启动子复合物.阻遏蛋白实际上使RNApol贮存在启动子上。,这一模式是否存在于其它操纵元系统中？,6.1.5lacoperon的正调控1代谢物阻遏效应,实验，在lacGlu培养基上E.coli只利用G，只有G耗尽时，才会利用lac葡萄糖抑制lacmRNA的转录：可阻止诱导物引起的阻遏物失活效应仅去掉阻遏物并不能启动lac基因表达,有其它因素参与,葡萄糖对lac操纵元表达的抑制是间接的葡萄糖的降解是通过cAMP与CAP结合起作用的cAMP:环化腺苷酸,CAP,cataboliteactivatorprotein由crp编码CRP,catabolitereceptorprotein,2CAP结合位点,CAP为二聚体，45KD，被cAMP激活结合位点22bpI-70-50II-50-40,由于序列的差异，使不同基因受cAMP激活的水平不同,结合位点序列保守,3CAP的结合对DNA构型的影响,DNA弯曲弯曲点位于CAP结合位点二重对称的中心弯曲使CAP能与启动子上的RNApol接触,（1）CAP结合位点与转录起始点的位置CAP与转录起始点的距离，相距数个整双螺旋CAP结合位点在启动子的上下游，都能发挥作用,4CAP对转录的影响,（2）基因转录对cAMPCAP系统的依赖性，与启动子本身的效率有关,cAMP-CAP复合物的结合，使位点II附近的富含GC区域双螺旋结构稳定性降低，因而-10区的熔解温度降低，促进开放型启动子复合物的形成,（3）CAP激活转录的方式,CAP直接作用于RNApol亚基缺失RNApol亚基的C末端时，失去受CAP激活的能力作用于DNA，改变其结构,6.1.6lacoperon的其它问题,lacoperon的功能是在正负两个调控体系的协调作用(coordinateregulation)下实现的。阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用；如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从P上解聚仍无转录活性CAP组成型合成，所以cAMPCAP复合物取决于cAMP含量腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的酶有关，因此cAMPCAP调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖类代谢有关的酶降解物敏感型操纵元：只要有葡萄糖存在，这些操纵元就不表达,2.A基因及其生理功能编码-半乳糖苷乙酰基转移酶，使半乳糖苷乙酰化。该酶不参与乳糖代谢！生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，积累，抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后，即无毒.所以lacA虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累3.lac基因产物数量，1：0.5：0.2不同酶的数量差异,是由于在翻译水平上的调节.方式有二:核糖体脱离:多顺反子的差别性翻译内切酶作用:在lacmRNA分子内部，a基因比z基因更易受内切酶作用,Summary,Summaryoflacoperonregulation,6.2Trpoperon,生物细胞中的氨基酸合成，也受操纵元的调节。细胞需要某种氨基酸时，其基因即表达，不需要时基因关闭，达到经济的原则。,trpR,阻遏蛋白P，-40+18O,-21+1L,+1+162结构基因,t,A下游36bp,不依赖pt,t下游250bp，依赖p,6.2.1基因组成,sne298,6.2.2Trpoperon的阻遏系统,1TrpR四聚体,阻遏蛋白trp有活性的阻遏物,SNE299,trpO不转录,2阻遏蛋白的结合位点trpO-21+1，反向重复序列trpP-40+18活性阻遏物与trpO的结合与RNApol与启动子的结合发生竞争SNE299,3阻遏系统,主管转录是否启动，在缺乏Trp时，mRNA起始合成，但不能自动延伸，一般在trpE之前终止转录,粗调开关,6.2.3弱化作用attenuation,1弱化子，衰减子，前导RNA，140bp,弱化子，衰减子，,序列分析发现，其中4个片段进行配对，形成不同的二级结构,S312,2前导肽14aa,3转录弱化作用,Lackoftrp,LackofaminoacyltRNA,Ribosomepauseattrpcodons,occludingsequence1,Form2:3hairpinanti-terminator,TranscriptionintotrpEandbeyond,Hightrp,Trpisinsertedatthetrpcodons,Translatetotheendofleadermessage,Ribosomeoccludesequence2,Terminatetranscriptionat(3:4formterminator),弱化子对转录调控的关键,空间结构，10thand11thcodonsencodetrpresidues(rareAA)时间，核糖体停顿在2个Trp密码子上时，产生延宕，此时4区未转录出来,Theleaderpeptideistodeterminertrpavailabilityandtoregulatetranscriptiontermination,14amino-acid(encodedby27-68oftheleaderRNA,summary,6.2.4阻遏作用与弱化作用的协调,阻遏效率启动子的转录起始频率在R+和R-相差70倍弱化作用trp存在时，约有10的RNApol侥幸转录-trp活性阻遏物无活性阻遏物+trp,trp操纵子具有双重调节体系？,Negativerepressibleoperon可以被最终合成产物所阻遏,为什么需要阻遏体系？当大量Trp存在时，阻遏系统起作用。阻遏物与之结合，阻止先导mRNA合成。,经济,仅有少量trp时，RNApol启动，但在L.S.处脱落，转录中断,不足以结合O位点,为什么需要弱化系统？当trp浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极慢，不能很快引发trp合成。因此需要一个能快速作出反应的系统，以保持培养基中适当的Trp水平。,6.2.5细菌演化出弱化系统的生物学意义,通过tRNA荷载与否进行调控，更为灵敏氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而tRNA荷载为标准进行调控更为恰当两个调控系统，避免浪费提高效率阻遏系统高水平trp时，不转录低水平trp时，转录至LS弱化系统细调,原核生物细致的精细调控机制,增强原核生物对环境的适应性,6.2.6正控制系统和负控制系统,1负控制系统：在没有调节蛋白质存在时基因表达，加入调节蛋白后基因表达活性被关闭阻遏蛋白：负控制系统中的调节蛋白,Addsignalmol.Operonoff,Addsignalmol.Operonon,(inducibleoperon),(repressibleoperon),2正控制系统：,没有调节蛋白质存在时基因关闭,加入这种调节蛋白质后基因活性被开启诱导蛋白,三、其他操纵子的调控机制,1半乳糖操纵子大肠杆菌半乳糖操纵子(galactoseoperon)包括3个结构基因：异构酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)，半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactosetransferase,galT)，半乳糖激酶(galactosekinase,galk)。这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。GalR与galE、T、K及操纵区O等离得很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。,gal操纵子的特点：它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录；它有两个O区，一个在P区上游-67-53，另一个在结构基因galE内部。,因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存在时，gal操纵子仍可被诱导。现已分离到一些突变株，其中一类突变株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类（gal结构基因高效表达）；而另一类突变株中gal基因的表达完全依赖于葡萄糖，培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的gal基因不表达，不合成半乳糖代谢酶类。,分析gal操纵子P-O区的DNA序列发现，该操纵子确实存在两个相距仅5bp的启动子，可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时，转录从S1开始，当无cAMP-CAP时，转录从S2开始。,为什么gal操纵子需要两个转录起始位点？半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质-尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产物。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。现在设想只有S1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。假如唯一的启动子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于cAMP-CAP的启动子（S1）对高水平合成进行调节。,2阿拉伯糖操纵子阿拉伯糖(arabinose)是另一个可以为代谢提供碳源的五碳糖。在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因：araB、araA和araD，分别编码3个酶：araB基因编码核酮糖激酶(ribulokinase)，araA编码L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinoseisomerase)，araD编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(L-ribulose-5phosphate-4epimerase)。与araBAD相邻的是一个复合的启动子区域和一个调节基因araC，这个AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能。AraBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。在标准的遗传学图谱上，araBAD基因簇从启动子PBAD开始向左进行转录，而araC基因则是从Pc向右转录。,AraC蛋白作为PBAD活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的两种异构体来实现的。Pr是起阻遏作用的形式，可以与现在尚未鉴定的类操纵区位点相结合，而Pi是起诱导作用的形式，它通过与PBAD启动子结合进行调节。在没有阿拉伯糖时，Pr形式占优势；一旦有阿拉伯糖存在，它就能够与AraC蛋白结合，使平衡趋向于Pi形式。这样，阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为阿拉伯糖与Pr的结合，使Pr离开它的结合位点，然后，产生大量的Pi，并与启动子结合。,因为培养基中含有葡萄糖，所以cAMP-CAP没有与操纵区位点相结合，AraC蛋白处于Pr形式并与A位点结合，RNA聚合酶很少再与Pc结合，araC基因虽然仍有转录，但受到抑制，只有少量AraC蛋白形成，整个系统几乎处于静止状态。没有葡萄糖，也没有阿拉伯糖，因为没有诱导物，尽管有cAMP-CAP与操纵区位点相结合，AraC蛋白仍以Pr形式为主，无法与操纵区B位点相结合，无araBADmRNA转录。无葡萄糖，阿拉伯糖时，大量araC基因产物以Pi形式存在，并分别与操纵区B、A位点相结合，在cAMP-CAP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表达，操纵子充分激活。,3.组氨酸操纵子与His降解代谢有关的两组酶类被称为hut酶(histidineutilizingenzyme)，控制这些酶合成的操纵子被称为hutoperon。由一个多重调节的操纵子控制，有两个启动子，两个操纵区及两个正调节蛋白。Hut操纵子共编码4种酶和一个阻遏物。4种酶分别由hutG、hutH、hutI及hutU基因编码，阻遏物则由hutC基因编码。在产气克氏菌中，以上基因构成两个转录单位，hutI、hutG、hutC和hutU、hutH分别被转录合成两条mRNA长链。这两个转录单位各自都有一个启动子和一个操纵区，其转录过程都是从左向右进行的，hutC阻遏物能与每个操纵区相结合。,无论以组氨酸作为唯一碳源或氮源，hut操纵子都会处于有活性状态。Hut操纵子的每一个启动子上都有cAMP-CAP结合位点，当碳供应匮乏时，能合成cAMP，出现cAMP-CAP复合物，并与操纵区上的相应位点结合，诱发基因转录。虽然尚不清楚氮源缺乏时的信号是什么，但它很可能也是一个正效应子。,4.多启动子调控的操纵子,IrRNA操纵子大肠杆菌rRNA操纵子（rrnE）上有两个启动子，P1和P2。P1是强启动子，营养充沛时，由P1起始的转录产物比由P2起始的转录产物高3-5倍。当营养匮乏时，P1的作用被抑制，但P2仍有功能。,II.核糖体蛋白SI操纵子核糖体蛋白SI操纵子（rpsA），它也受应急反应调节。RpsA有4个启动子，P1、P2是强启动子，平时主要依靠它们来启动基因的表达，合成SI蛋白。P3、P4是弱启动子，只有在紧急情况下，P1、P2启动子受ppGpp的抑制，由P3、P4起始合成的SI蛋白维持了生命的最低需要。,III.DnaQ蛋白操纵子DnaQ蛋白是DNA聚合酶全酶的亚基之一，其主要功能是校正DNA复制中可能出现的错误。在RNA聚合酶活性较低时，操纵子的转录由弱启动子P2控制；而RNA聚合酶活性较高时，就开始利用强启动子P1。,6.3基因转录的时序调控,概念：原核生物在生长发育的各个阶段，基因的表达是按照一定时间顺序进行的意义有效利用能源避免不适当的表达，造成的危害途径亚基的更换（枯草杆菌，E.coli，T4phage）T7噬菌体生长过程中RNApol的替代噬菌体基因表达的调控,亚基的更换,6.3.1枯草杆菌噬菌体SPO1早中晚基因表达的转换SPO1，烈性噬菌体如何实现早中晚基因表达的转换?通过更换亚基，使SPO1的早中晚基因有条不紊地表达,因子的负责识别启动子的保守序列，是转录起始唯一需要的因子。许多细菌能生产多种可取代的因子，以识别不同的启动子。当细胞从基本的转录机制转入各种特定基因表达时，需要不同的因子指导RNA聚合酶与各种启动子结合,早期，255，产生gp28,gp28取代55,中期，gp28取代55产生gp33,gp34,晚期,gp33,gp34取代gp28，55,枯草杆菌中每个因子都能识别具有特征性的一致序列的一组启动子,调节蛋白质相互取代的原因，可能是它们与核心酶的亲和力所决定的,