【毕业学位论文】（Word原稿）设施辣椒根腐病病原鉴定及检测技术研究植物病理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 设施 辣椒根腐病病原鉴定及检测技术研究 I 摘 要 近年来，由于设施 辣椒 栽培面积的连年扩大，轮作倒茬越来越困难，辣椒根 腐病 已经成为我国北方设施辣椒 可持续发展的限制性因子之一。本论文针对辣椒根腐病病原不清，防治药剂不得当引起防效差的问题，开展了设施辣椒根腐病病原鉴定及检测技术研究。 1 对来自 北京 阳坊 、山东寿 光、辽宁瓦房店等地 不同辣椒产区的根腐病病原进行了分离培养和鉴定，根据其 形态特征、培养性状、生化特性以及致病性测定 结果 ， 将该病原菌鉴定为辣椒疫霉 病原菌具孢子囊，形态变化大， 椭圆形、近球形、卵形或不规则形 ，孢子囊平均大小为 （ （ m，长宽比为 突明显，呈半球形，一般单乳突，偶见双乳突，乳突长为 原菌不产生 厚 垣孢子；除辣椒外，人工接种还可侵染黄瓜、番茄、茄子，不侵染油菜和白菜；对孔 雀石绿不敏感，能够利用淀粉。 2 运用免疫学技术，建立了检测辣椒疫霉的间接 斑点 法。本研究 首先以辣椒疫霉菌体可溶性蛋白作为免疫原，通过免疫家兔制备了高效价的抗血清，并进一步提取和纯化了抗体 实验室条件下从样品稀释度、抗体孵育时间、抗体工作浓度、酶标二抗孵育时间、酶标二抗工作浓度等几个方面对 测方法进行了实验条件的优化。结果显示，在间接 中， 最佳封闭液及封闭时间分别为 372h； 抗体最佳工作浓度及孵育时间分别为 37 标二抗的最佳工作浓度及孵育时间分别为 800和 37 2h；底物显色的最佳作用时间为 37 15 中， 抗体最佳工作浓度为 原抗体间的最佳作用时间为 37 标二抗的最佳工作浓度和孵育时间分别为 600 倍和 37 以上两种检测方法 的稳定性好、特异性强，检测的灵敏度高 ， 可用于田间实际检测。 本研究 首次鉴定了 引起 我国北方 地区辣椒根腐病的病原为辣椒疫霉 ， 为正确用药、合理防治上述地 区辣椒根腐病提供了理论依据 ；同时 本研究 建立的辣椒疫霉检测方法 ， 为 该 地区 设施 辣椒根腐病 的早期诊断与防治、病害的监测和预测预报提供了一条行之有效的技术手段。 关键词： 辣椒根腐病 ， 辣椒疫霉 ， 病原鉴定 ， 酶联免疫吸附测定 ， 斑点免疫吸附测定 of in is of to in to in of is to to 1. to it to of (m, of to of of t it t It is to 2. to . of to as gG by RP gG so h 7 . of RP gG mL 7 00 h 7 , of 57 . in of RP gG mL 7 00 7 , be to in In we to of We of 录 第一章 绪论 . 1 国设施辣椒根腐病发生状况 . 1 椒根腐病的调查采样 . 1 施辣椒根腐病发病症状 . 1 物病原真菌检测技术研究进展 . 2 统植物病原真菌检测技术 . 2 疫学检测技术 . 3 子生物学检测技术 . 5 研究的目的和意义 . 7 研究的试验设计路线 . 8 第二章 辣椒根腐病病原的鉴定 . 9 验材料 . 9 验所用材料及设备 . 9 验所用培养基 . 9 验所用植物材料 . 10 验方法 . 10 原菌的分离和纯化 . 10 原菌的致病性测定 . 10 原菌 的培养特征 . 10 原菌的形态特征 . 11 原菌对孔雀石绿的敏感性 . 11 原菌对淀粉的利用 能力 . 11 果与分析 . 11 原菌分离情况 . 11 原菌的致病性测定结果 . 11 原菌的培养特征结果 . 12 原菌的形态特征观测结果 . 12 孔雀石绿的敏感性测定结果 . 13 淀粉的利用能力测定结果 . 14 原菌的鉴定 . 14 章小结 . 14 第三章 辣椒根腐病病原多克隆抗体的制备 .验材料 . 17 验所用材料和仪器 . 17 试验主要试剂的配制 . 17 验方法 . 18 株培养及菌体可溶性蛋白提取 . 18 验动物的选择及抗血清制备 . 19 血清的效价测定 . 19 析袋的处理及使用 . 20 体的粗提 . 20 提抗体 纯化与浓度测定 . 20 泳法检测抗体的纯度 . 21 果与分析 . 21 体可溶性蛋白的浓度测定结果 . 21 血清的效价测定结果 . 21 化后抗体的浓度测定结果 . 23 体纯度的检测结果 . 23 章小结 . 24 第四章 辣椒根腐病病原间接 测方法的建立 .验材料 . 25 验所用试剂及溶液 . 25 验所用菌株 . 25 验方法 . 26 接 本操作程序 . 26 接 佳工作条件的确定 . 26 接 的稳定性检测 . 28 接 的特异性检测 . 28 接 对纯培养菌体蛋白灵敏度的检测 . 28 接 田间检测效果的评价 . 28 果与分析 . 28 接 最佳工作条件的确 定结果 . 28 接 的稳定性检测结果 . 32 接 的特异性检测结果 . 33 接 对纯培养菌体蛋白的灵敏度检测结果 . 34 接 田间检测效果的评价结果 . 34 章小结 . 35 第五章 辣椒根腐病病原 测方法的建立 .验材料 . 36 验所用材料 . 36 验所用溶液及其 配制 . 36 验方法 . 36 V 接 本操作程序 . 36 接 最佳工作条件的确定 . 37 接 的特异性检测 . 38 接 对纯培养菌体蛋白的灵敏度检测 . 38 接 田间检测效果的评价 . 38 果与分析 . 38 接 佳工作条件的确定结果 . 38 接 的特异 性检测结果 . 41 接 对纯培养菌体蛋白的灵敏度检测结果 . 41 接 的田间检测效果评价结果 . 42 章小结 . 42 第六章 结论与讨论 .论 . 44 论 . 44 于辣椒根腐病的病原 . 44 于免疫原 . 45 于抗体的特异性 . 45 于 显色系统 . 45 于两种检测方法的比较 . 46 后记 .考文献 .谢 .者简历 .文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 联免疫吸附测定 制性片段长度多态性 机扩增多态性 增片段长度多态性 血清白蛋白 氨基联苯 胺 h 时 根过氧化物酶 免疫球蛋白 G kg 克 mg 克 mL 升 甲基联苯胺 密度 丙烯酰胺凝胶电泳 酸盐缓冲液 分钟转数 准差 g 克 酸盐缓冲液 s 氏完全佐剂 s 氏不完全佐剂 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 甜椒 (.)系茄科辣椒属，一 年或多年生草本植物。其营养丰富，含有人体所需的多种维生素、糖类、类胡萝卜素、有机酸，是一种具有重要经济价值、深受我国各地人民喜爱的调味品和蔬菜（孙晓勇， 1999），目前辣椒已经成为我国农业生产的一个重要产业，具有重要的意义。 近年来，我国 设施辣椒、甜椒种植面积 逐年扩大， 因棚室辣椒栽培在人工设施条件下进行，具有高温、高湿、弱光、小气候比较稳定的特点，有利于病原微生物的滋生、传播和 蔓 延，棚室辣椒病害种类、数量也随生 产 的发展而增多，危害逐年加重，尤其辣椒根部病害发病部位隐蔽、病 程长、症状不明显，不易及时发 现，病害容易大面积发生，迫使菜农用药次数增加，药量加大，造成蔬菜的农药污染加重，给 环境和 人民健康带来威胁。 国设施辣椒根腐病发生状况 椒根腐病的调查采样 目前，辣椒根腐病已在我国北京、天津、山东、 河北、辽宁、 山西、河南、福建、青海、江西、浙江等省市爆发流行，造成了严重的经济损失，危害程度有逐年加重的趋势。 2004 2006 年期间，对北京 阳坊 、山东寿光、辽宁瓦房店等蔬菜生产基地辣椒生产情况进行了调查，发现辣椒根腐病发生严重，很多保护地辣椒发病率高达 50%，甚至全棚绝收。山东省寿光市是我国重 要的蔬菜产区，辣椒是主要种植作物之一，而且辣椒品种多为国外特色品种。 2004年 10 月调查发现当地农民仍使用传统的防治 镰刀菌引起的根腐病 药剂进行防治，而且多为发病后才进行防治，效果不佳；山东省 寿光 市是 我国 蔬菜的 重要 产区，由于管理比较粗放，造成辣椒根腐病发生严重。北京市南口通讯部队蔬菜生产基地管理正规，但连年种植，土壤中病原菌积累，辣椒根腐病发生严重。 作者调查了上述蔬菜生产基地辣椒根腐病的 发 生 情况及症状， 选取具有代表性的田块进行调查 ，共 采集 辣椒根腐病样 145 株 。 施辣椒根腐病 发病 症状 设施 辣椒根 腐病在辣椒幼苗至成株期均可发 生 。初期症状一般表现为地上部一株几个枝发生萎蔫，早晚可恢复，严重时早晚不能恢复（图 1发病早的植株有矮化现象；根部腐烂，须根少且易断，主根、侧根及须根的表皮易剥离 （图 1，木质部变为淡褐色（图 1严重时会在茎基部造成腐烂，形成水渍状或环绕茎基部的病斑，表皮组织疏松易剥离，木质部变色。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 图 1椒根腐病田间危害症状 of in 1椒根部危害症状 of 1椒根部危害症状 of 物病原真菌检测技术研究进展 统植物病原真菌检测技术 传统的植物病原真菌的诊断方法往往根据病组织的症状、病原菌的特征以及研究人员的经验进行。但某些病原引起的症状相似，例如胡萝卜的细菌性枯萎病与交链孢黑斑病、不同病原物复合侵染造成的症状等等难以从 症状 上加以区别；有些病原菌 不能进行纯培养。因此传统检测方法对检测人员有较高的要求，而且检测的准确性较差，不能适应现代植物病害快速、准确诊断的要中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 求。 疫学检测技术 植物免疫学检测技术是伴随着医学免疫学及动物医学免疫学的不断发展而发展起来的，它是以抗原与抗体的特异性反应为基础而发展起来的一种技术。应用血清学技术检测植物病原菌的历史可以追溯到 1918 年，发展至今，已经发展成为一门成熟的技术。目前免疫学技术己广泛应用到植物病毒的检测中，在植物病原真菌的检测中还不普遍，但最近十几年来免疫学技术在病原真菌的检测方面发展较快，显示 了常规方法所不具有的优点： (1)简单、快速、准确、灵敏； (2)可检测未显示症状时的病原； (3)可检测症状不典型或与其它病原物复合侵染时的情况； (4)可定量检测病原物； (5)可同时检测大量样品； (6)可制成试剂盒。因此，在田间进行检测诊断时，勿需对病原真菌进行分离即可进行准确、快速的检测。 于抗原 植物病原菌中用作抗原的物质包括完全细胞、菌丝体或孢子、破碎的细胞、细胞的液体培养过滤液或固体培养物浸提液、以及纯化的蛋白质与酶 （ 1996） 、毒素 （ 1989； 999； 2001） 与多糖等 （李亚宁， 2003） 。真菌抗原存在特异性，但特异性是相对的，特异性是相对于分类单位而言的。比如某一抗原成份对属来说是特异的，但它对这个属中的各个种而言则可能是公共抗原，它不能将这个属中的各个种有效地区别开来；同样，一抗原成份对某一个种的真菌而言是特异的，但对这个种中不同型生理小种或菌株来说则又可能是公共抗原成份。同时特异性抗原成份和共性抗原成份总是同时存在的，如某种微生物它具有种特异性抗原成份，同时也可能还具有这种微生物所在属的属特异性抗原成份，因而要获得特异性抗 原成份，必须根据实验要求采用适当的分离手段将它分离提取出来。影响真菌抗原特异性的因素很多，包括真菌的种类、培养条件、培养基组成、菌龄、抗原提取所采用的方法以及免疫动物的选择、抗体的分离方法和所采用的抗原抗体的分析方法等等。 于抗体 植物病原真菌抗体的产生同其 它 抗体产生一样，常以家兔、小白鼠作为免疫动物，也可以用蛋鸡等作为免疫物，从而获得多克隆或单克隆抗体。到目前为止已有密环菌属 （ 、刺盘 孢 属 （ 、镰刀菌 （ 、腐霉属 （ 、核盘菌属 （ 等属的植物病原真菌的抗原被制备为单克隆抗体。然而由于生产单克隆抗体的技术要求较高，生产成本也比多克隆抗体高出许多，因而日前大多数研究者仍用多克隆抗体进行研究。 对抗体的分离、提纯是必要的，特别是对于多克隆抗体，因为绝对专一的抗体是不存在的。任何抗体都或多或少会和异质的同种抗原发生交叉反应。为了尽可能地减少交叉反应，可以采取交叉吸附与免疫亲和层析或印渍等方式进行分离纯化、浓缩特异性抗体。通过这些方法提纯浓缩后的抗体，其特异性大 大加强，但由于除去了抗共性抗原的抗体而使灵敏度有所下降，因此只有通过提高抗体的使用浓度来弥补灵敏度的损失。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 联免疫吸附测定法（ 免疫学检测技术中最常见的是 酶联免疫吸附测定法（ 1971 年 表了酶联免疫吸附测定（ 于 量测定的文章 （ 徐宜为 ， 1991） ，使得 1966 年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法 （ 1987） 。 先是用于病毒的检测，由于其具有快速、灵敏、特异、操作简便等优点而受到世界各国科学家的重视。从 80年代开始， 术开始用于植物病原细菌及真菌的检测。 酶联免疫吸附测定法的基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时 ，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故极大地放大了反应效果，从而使