【毕业学位论文】（Word原稿）小麦重要SSR位点的发现及其与农艺性状的关联分析生物化学与分子生物学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 小麦重要 点的发现及其与农艺性状的关联分析 h. D. 中国农业科学院博士毕业论文 摘要 I 摘 要 自然选择和人工选择是推动作物进化的主要动力，它们推动 作物向着既适应特定生态环境又满足人类需要的方向发展。从群体遗传的角度来看，选择通常会造成基因组中靶位点的多态性降低，同时也会产生选择牵 连效应，致使 “靶基因侧翼序列的遗传多样性降低、连锁不平衡性增加、位点的等位变异发生偏分布 ”，而基因组的其它区域遗传多样性一般不会发生明显改变，这种现象被称为选择牵连效应（也称搭载效应）。选择牵连效应为我们寻找与定位被选择基因提供了线索。 本文主要研究以下两个方面的问题：首先，以我国 5 029 份 小麦初选核心种质在 78 个 寻了等位变异发生严重偏分布的 点，并证实了其侧翼的确存在着重要的农艺性状基因；其次，以郑引 4 号、郑引 1 号及其衍生品种和部分亲本共 140 个品种（系 ）为材料，探讨了在郑引 4 号及其衍生后代品种间是否存在可保守遗传的染色体区段等问题。得到如下结论： 1. 我国小麦初选核心种质群体结构不明显，是进行关联分析和选择牵连效应分析的理想群体。 2. 图和关联分析的结果显示，在初选核心种质中， 22 个 等位变异严重偏分布 的 点附近存在着控制重要农艺性状基因或与生态适应性相关的基因（或 点），初步证明选择牵连效应分析是一种比较有效的作图方法。 3. 通过标记 /性状关联分析，找到了对千粒重、穗长、分蘖、株高等性状影响较大的基因组区段，并与以往的 图的结果基本相一致， 还检测到一些新的位点（或区段）。 4. 将郑引 4 号与其衍生品种进行对比分析，发现 1B、 2A 和 5A 三条染色体上存在 13 个具 “选择信号 ”的可保守遗传的基因组区段，这些染色体区段内的确存在着控制重要农艺性状基因或与适应性相关的基因（或 5. 以上述发现为基础，以我国小麦核心种质育成品种为材料，进行上述保守遗传染色体区段内16 个 点等位变异数据与 6 个重要农艺性状数据之间进行关联分析，发现 14 个 点与重要农艺性状存在一定的关联度，其中 12 个位点与千粒重存在关联， 7 个位点与株高、6 个位点与有效分蘖、 5 个位点与 穗粒数、 4 个位点与穗长、 3 个位点与 小穗数之间存在较强的关联。其中一些相邻的 点所反映的选择牵连效应，可能是对同一个功能区段（ 基因）的选择所造成的。 6. 以选择牵连效应分析为基础，通过标记 /性状关联分析是重要基因作图的新思路，可能是资源研究的一条新途径。不仅可以找到重要的基因组区段，还可找到最优异的等位变异（基因）。完全有可能从基因组水平揭示亲本的育种配合力 ,为分子设计育种奠定理论和材料基础。 关键词： 驯化 ； 育种 ； 选择 ； 牵连效应 ； 关联分析 ； 核心种质 中国农业科学院博士毕业论文 摘要 to at to a of at is or is to in SR in 5 029 8 to to be at by of 64 06 0 B, 2A A 40 64 06. 1. is it no 2. or to in by 2 of TL is an to 3. 000by by TL in in 4. B, 2A A in 64. or to by 5. to be in 6 in In 12 0007 6 5 4 or SR 6. be by of of or by in be it is of in or be in at 录 摘 要 . I 第一章 数量性状遗传作图的基本思路与方法 . 1 然选择、人工选择与选择牵连作用的产生 1 然选择、人工选择与生物进化 . 1 然选择和人工选择对生物基因组多样性的影响 . 2 择牵连作用作图法 (. 4 图与关联分析技术 5 图 . 6 联分析 . 6 研究的目的和意义 11 第二章 小麦初选核心种质的遗传结构分析 及选择牵连效应初探 . 13 料与方法 13 验材料 . 13 究方法 . 14 果与分析 15 国小麦初选核心种质中 等位变异严重偏分布 的 点 . 15 国小麦初选核心种质育成品种的群体结构分析 . 17 记 /性状关联分析结果 . 17 论 23 国小麦初选核心种质是进行关联分析的理想作图群体 . 23 择牵连效应分析与关联分析相结合，是进行作物重要基因 发掘的有效方法 . 24 本章结论 . 26 第三章 郑引 4 号及其衍生品种中 1B、 2A、 5A 染色体 保守遗传区段浅析 . 27 料和方法 27 验材料 . 27 究方法 . 28 果与分析 34 引 4 号衍生品种的多样性变化分析 . 34 引 4 号和郑引 1 号衍生品种 点等位变异变化分析 . 39 保守遗传的 点在我国小麦核心种质中的性状 /标记关联分析 . 42 论 46 郑引 4 号 “易出品种 ”原因初探 . 46 本章结论 . 48 参考文献 . 49 致 谢 . 65 作 者 简 历 . 66 中国农业科学院博士学位论文 第一章 数量性状遗传作图的基本思路与方法 1 第一章 数量性状遗传作图的基本思路与方法 小麦是世界上 最重要的 粮食作物 之一 ，全球约有 35%的人口以小麦为主食。在我国，小麦是仅次于水稻的第二大粮食作物，常年种植面积在 2 上，约占粮食作物面积的27%；总产量为 1 亿吨以上，约占粮食作物产量的 22%（庄巧生， 2002）。不断提高小麦的产量、品质 、 抗病性 和适应性 是现代小麦育种家追求的主要目标，也是满足人口不断增长和人们物质文化生活 水平 不断提高需 求的基础 。小麦品种的改良有赖于 所掌握的遗传资源 和 人类对农艺性状遗传基础的了解与掌握 的程度 。 作物的性状特征从整体上看可分为两类，即由单基因控制的表现为非连续变异的质量性状和由多个基因控制的表现为连续变异的数量性状。作物的许多主要农艺性状，如产量、品质、抗病性、抗逆性等都表现为数量性状。由于任何一个数量性状特征都是由基因组中的多个基因和环境效应共同作用的结果，因此对其遗传基础的研究十分困难。随着分子生物学和生物统计技术的发展， 应运而生 的 图（ 术和关联分析（ 术，为数量性状遗传的研究打开了崭新的一页（ 2001）。由于小麦基因组的复杂性，目前，人类 对 其基因组 的了解与掌握程度远低于水稻和玉米等作物 。 因此，利用 数量性状位点的 作图技术，对 控制 小麦重要农艺性状 的 基因进行定位与作图尤 其 重要 ， 它不仅可以为分子标记辅助选择和未来的分子设计育种准备 基因资源 ，也可以为相关 基因的克隆 奠定 基础。 在作物 5 00000 年的驯化与栽培史中， 人工选择和自然选择是促进作物（基因组）进化的两种动力，它们推动 作物向 着 既适应特定生态环境又满足人类需要的方向发展。近年来出现的以群体遗传学和进化分析为基础的选择牵连作用作图 （ 技术，为数量性状遗传的研究提供了新的思路，它必将与 图技术和关联分析技术相互补充、相互印证，共同促进作物功能基因组 学和育种学的 研究 和 发展。 然选择、人工选择与选择牵连作用的产生 然选择、人工选择与生物进化 达尔文认为， 进化中的各种群体都存在着广泛的变异，其中有些变异对生物的生存 和繁衍有利，有些对生物的生存有害，在生存斗争（包括生物与无 机环境的斗争、种间斗争和种内斗争三方面）中，对生存 和繁衍 有利的变异得到保存，对生存有害的变异 遭 到淘汰，这种对有利变异的保存和对不利变异的排除就称之为自然选择。自然选择的结果是群体发生了适应性的变化，它可以导致群体对较稳定生态环境条件的更好适应，也可以使群体适应变化着的生态环境。中国农业科学院博士学位论文 第一章 数量性状遗传作图的基本思路与方法 2 从分子水平上讲，这种变化是通过更有利的基因来替换原有的基因而产生的。当群体中产生新的有利基因，或由于环境条件的改变，现有的野生型等位基因变得不适应 或 不利于 生存和繁衍时，它就会逐渐被 新的 有利 突变（ 等位基因 ） 所替代（ 陈家宽和杨继， 1994） 。自然界中的所有生物都处在自然选择 和 进化 之 中。 人工选择是通过人工的方法保存具有 优异 变异的个体和淘汰具有 “不良 变异 ” 的个体，以改良生物的性状和培育新品种的过程。人工选择是在人工条件下的生物进化过程，是人工控制的生物进化。它与自然选择存在着 明显的 区别：首先，人工选择所保留的变异主要对人有利，而自然选择所保留的变异对生物的生存与 繁衍 有利；其次，在人工选择里发生作用的是人，它是以人类的好恶作为选择的标准（生产性能、经济价值、娱乐观赏价值等），表现出很强的目的性，而在自然选择里发挥主导作用的是自然条件，它完全是生 物与环境之间互作的历史过程，是按照具体的自然条件进行的，既无目的性，又无预见性；再次，人工选择见效快，在短时间内， 如 5 年左右，就可培育出新的品种，而自然选择见效一般需要很长的时间（ 方宗熙， 1964） 。 当然，在作物的人工驯化和现代育种中，人工选择和自然选择是紧密联系在一起的，它们共同推动作物的进化。现实生活中我们种植的每个作物品种，都不仅是人工选择的产物，同时也是自然选择的产物，它在符合人类的某些要求的同时，也必需适应特定的生态环境条件。而那些 对人类有利但对作物生存有害的变异是难于保存 下来 的，最终会被自然淘 汰。 然选择和人工选择对生物基因组多样性的影响 分子进化的中性理论 认为， 有利 ”和 “不利 ”两种，它们在选择上常常是中性或近于中性的，任何一个突变得到保留是由于 某 一特殊基因随机固定 的缘故 ，而不是由于选择的作用。然而，近年来越来越多的研究表明，在生物的进化过程中，基因组 中 许多基因都经历了正 向 达尔文选择作用。例如，对果蝇蛋白质的研究发现，其氨基酸发生的替代作用大约有 40以上受到了自然选择的 影响（ u 2001; et 2002; 2002）。对欧洲果蝇 109个基因组片段的序列分析 发现其中有 12个片段存在着选择的痕迹（ 2004）， 2002）也在850个经受选择作用的基因， 2003）的研究也证实在非洲果蝇的 人类的基因组中，非洲人群的 它 人群的 都被证 明 经历过较强的选择作用（ 2002） 。另外，人类蛋白质中 绝大部分 氨基酸替代作用与自然选择有关 (et 2001)。对疟原虫（ et 2002）、牛（ et 2003）、狗（ et 2004）、老鼠（ 2000）等动物基因组的研究也发现了较多的选择作用。 受自然选择和人工选择双重作用 较强 的作物品种，其基因组中的许多基因更是深深地留下了选择的烙印。对玉米的研究发现，其基因组中大约有 2基因（大约有 1 200个基因）在驯化中国农业科学院博士学位论文 第一章 数量性状遗传作图的基本思路与方法 3 和现代育种中经 受 了选择（ et 2002; et 2004），玉米第一号染色体上 21个基因的序列分析发现，有三个基因 （ 经 受 了选择的作用（ et 2001）。在由大刍草向玉米进化的驯化过程中， 与 株型相关基因 座 藏蛋白表达调节基因 座 et 1997； et 1998; et 2003）；在现代玉米育种中，控制其胚乳颜色的基因 经受 了育种家的选择作用 (et 2003, 2004)； 米的另一个与其淀粉合成相关的基因 ， 在驯化和育种中经历了选择的作用（ et 2003）。 研究发现，水稻的 2002）、控制小麦株高和产量的基因 et 1999）、控制西红柿果实大小的基因 et 2000）、花椰菜的开花相关基因 座 et 2000） 、向日葵的含油量相关基因 座（ et 2002）等都 保留了 选择的痕迹。 在生物的自然进化中，当某一 “有利 ”变异（或等位基因）被选中保留并逐渐固定下来后，后代群体中具有此等位基因个体的 比例 将会大大增加，而具有其它等位基因个体的会逐渐减少至消失，因此该位点的遗传多样性急剧下降。同时，由于遗传连锁，该位点两侧 的侧翼序列（包括其中性位点）也会随着 “有利 ”等位基因的固定而大量保留下来，致使其遗传多样性也大大降低。遗传学中就将这种对个别基因的选择致使其侧翼序列遗传多样性降低的现象称为选择牵连作用（ 但未受选择影响的基因组的其它区域，其多样性并不会发生改变（ 1974）。 在作物的驯化和现代育种中，为了 提高产量、 改良作物的农艺性状、食物的口感和营养品质，人们不断地对目标性状实施了选择作用，这些人工选择作用同样也会产生选择牵连作用，致 使靶基因位点及其两侧侧翼序列的遗传多样性降低（ et 2002; et 2002）。选择牵连作用的强弱主要与被选择位点所在基因组区域的重组率和对之实施的选择压的大小有关。若此区的重组率较低，并且所经受的选择压较高，则产生的选择牵连作用较强；反之，产生的选择牵连作用较弱 (2001)。而当某区的重组率为 0 时，则可产生完全的选择牵连作用，可能会造成该区段 列多态性的完全丧失（ u, 2000）。但由于染色体重 组的存在，这种情况一般不会发生（ et 2002）。果蝇的数据显示，当某位点所遭受的选择系数 s 为 10区的重组率为 10蝇基因组重组率的平均水平）时，受选择牵连作用的影响，其侧翼 500序列还可存在 10的多态性（ et 1992） ；当某位点所遭受的选择系数 s 仍为 10该区的重组率下降 10 倍（果蝇 X 染色体的重组率水平）时，其侧翼 5序列范围内才可存在 10的多态性（ et 1989） 。一般说来，对与生命休戚相 关基因的选择引起的选择牵连作用较强，对发育调控相关基因 的 选择引起的选择牵连作用较弱，而对重要农艺性状基因的选择引起的选择牵连作用也较强（ et 2002）。例如，由于选择牵连作用的影响，水稻 因两侧 500基因组区域的多样性降低（ et 2006），玉米 因上游 60基因组区域的多样性降低（ et 2004），玉米中国农业科学院博士学位论文 第一章 数量性状遗传作图的基本思路与方法 4 因上游 200区域 和 其下游 600区域都受其影响（ et 2004）。 另一方面，选择对群体遗传多样性的 改变， 不同 于 其它影响群体多样性的因素，诸如迁移、遗传漂变、重组和突变等 的作用 。迁移和遗传漂变的发生通常会造成群体整个基因组遗传多样性的改变，而重组和突变的发生通常只会增加该位点的遗传多样性，因此它们都不会造成基因组某个染色体区段遗传多样性的急剧下降。而只有选择作用，因能产生选择牵连作用才会造成靶位点及其两侧侧翼序列的遗传多样性显著下降。此外，选择作用的效应也不同 于 驯化中发生的瓶颈效应，瓶颈效应造成的是整个基因组遗传多样性的降低。 择牵连作用作图法 (自然选择和人工选择引起的选择牵连作用通常会产生三种效应：显著降低被选择位点（靶基因）及其两侧侧翼序列的遗传多样性 （ et 2001; et 2002; 2002） ；增加该基因组区段位点间的遗传连锁不平衡性（ et 1994; et 2000; et 2000; et 2002）；改变该区各位点等位变异的分 布模式，使它们产生偏分布（即不均衡分布） （ et 1995; et 2002; et 2002; 2005） 。并且，这三种信号还可以在后代群体中保留一定的时间。因此，利用这些 “选择信号 ”，我们极易对此类基因进行定位作图及功能分析，此法被称之为选择牵连作用作图法（ et 2002; 2003）。这种作图方法是一种寻求和鉴定具有优异等位变异基因组区段（或位点）的群体遗传学方法（ 2003） 。其基本思路就是：进行基因组扫描，找到存在 “选择信号 ”的基因组区段（或位点），并对之进行进一步的定位与作图。 越来越多的事实证明，选择牵连作用作图法是一种鉴定标记和定位与生态适应相关基因和作物重要农艺性状基因的有效方法。 2002年 非洲 果蝇群体 与 非洲果蝇群体 比较 ）是由于对其附近的一个与生态适应相关的有益变异的选择引起的，可利用选择牵连作用作图法将此有益变 异定位在几 个 et 2002）。利用田鼠杀鼠灵抗性基因 该方法 可将 et 2000）。 2002）在利用 01个基因进行扫描时发现，在 15个存在着选择信号的 7个已初步确定在其附近区域存在着与玉米驯化或改良有关的 来证实它们是 与穗型、粒重 相关 的主效 此，这种方法对作物重要农艺性状基因的鉴定与定位作图 也十分有效。 选择牵连作用作图法主要利用选择所产生的 “ 三种信号 ” 进行基因定位作图。例如，如果发现某位点的等位变异分布极不均匀，存在着高频等位变异（即其等位变异发生严重的偏分布现象），我们就可以断定此位点（或其附近区域）必 然 存在与生态适应 性 或与农艺性状相关的重要基因，这一基因在 过去 一定 经历 过很强的选择作用（ u, 2002），因此，我们就很 容 易中国农业科学院博士学位论文 第一章 数量性状遗传作图的基本思路与方法 5 对此基因进行定位与作图。同样，如果发现某位点的遗传多样性降低，或是此位点所在区域的遗传连锁不平衡性增加，我们也可以推测此位点（或其附近区域）可能 遭受 过选 择的作用。但是，事实上，并非所有我们 需要 定位的 基因座 在过去都经历了很强的选择作用，它们只是 经 受了一定的自然选择或人工选择的作用，因此在这些位点产生的 “选择信号 ”通常并不会十分明显，加之其它进化因素诸如重组、突变、遗传漂变、迁移、群体扩张、瓶颈效应等的影响，这些位点所在基因组区段一般不会出现 “高频等位变异 ”， 因而 我们很难依据单位点信息判断某基因组区段是否经历了选择的作用，必 须 进行多位点的分析。根据选择牵连作用的定义推测，存在选择作用的基因组区段其遗传多样性一般呈现一个 “V”字型变化，即以被选择 基因座 为中心向两 侧其遗传多样性不断增加，而其等位变异偏分布的程度从中心向两侧呈现不断下降的趋势。研究已证实，根据这一推断进行的多位点分析是寻求 “被 选择 基因 ”的有效途径，并可排除其它进化因素对基因组的影响（ 2003） 。特别是随着分子生物学的发展，各种生物高密度分子标记遗传连锁图的绘制完成，高通量基因型分析技术的日臻完善，为 更好地使用 这一方法 奠定 了坚实的基础。 然而，选择产生的三种 “信号 ”不会在后代群体中保留太长时间。当选择作用的靶位点实现了“高频等位变异 的过程后，该位点的遗传多样性就会丧失 ，而其两侧的侧翼序列也由于重组的发生，其多样性增加，位点间的连锁不平衡性逐渐降低以至消失。对这些位点的定位与作图，我们必需引入在该位点可能存在差异的其它群体，使其产生群体结构（ “恢复 ”其选择信号（ 2002）。事实上， 目前 我们使用的选择牵连作用作图 材料大部分 是混合群体 （ et 2002; et 2002） 。 选择牵连作用作图的方法体系已基本成熟（ 2003） ，具体可以分为 以下几步：（ 1）选择常用 分子标记（例如 构建 群体进行全基因组扫描；（ 2）利用 分子 数据，进行多位点分析， 寻找 与基因组其它部分存在显著差异（遗传多样性降低、连锁不平衡性增加、等位变异发生偏分布）的染色体区段（或位点）；（ 3）高密度扫描候选基因组区段，逐渐缩小目标基因（位点）所在区域；（ 4）利用一定群体候选区段的基因组序列或其 定出目标基因（位点）。 选择牵连作用作图已被证实是一种十分有效的 鉴定和标记重要农艺性状基因 及 与生态适应相关基因的方法，但是 ， 由于它 不能把基因 与 其功能联系起来，其应用受到一定限制。如果能将它和其它的作图方法 （ 图或关联分析 ） ，特别是与其使用同样作图群体 然群体 ”的关联分析方法结合起来，将更加有效。 图和关联分析是目前进行植物数量性状位点作图的常用技术。其中， 图是一种以遗传连锁为基础的传统的连锁分析（ 术，而关联分析，又称 析（ 是以连锁不平衡为基础 的作图技术。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 数量性状遗传作图的基本思路与方法 6 图 位的实质就是分析分子标记与数量性状位点之间的连锁关系（ 1998）。其主要做法是以标记基因型为分类依据把作图群体分成两组，比较两组间目标性状的差异显著性，以此推断该性状位点与标记位点的连锁关系。 图就是把 位的结果逐一定位到染色体的相 应 位置，并估算遗传效应 的大小 。适 当 作图群体的构建 和 高密度遗传连锁图谱的绘制是进行 位作图的先决条件。早在 1923 年， 试图利用形态标记来分析数量性状多基因间的连锁关系，但苦于标记的数量有限而未能 系统研究。在随后的几十年间，科研工作者利用形态标记、细胞学标记和生化标记，为主要作物遗传图谱的构建 做 了大量的工作，但由于可用的标记数量少，多数作物都没 有 建立一个完整的遗传图谱。二十世纪八十年代以后，随着 分子标记的相继出现与发展，大大地促进了遗传图谱的构建，各种作物构建的分子标记连锁图谱 也 越来越完善。 图群体 通常 选 择 两个性状差异大、 血 缘关系较远的材料作亲本构建 而成 。这些作图群体依据其群体的特点可分为两类：（ 1）永久性分离群体，主要包括重组近交系（ 加倍单倍 体（ 体、回交近交系（ 近等基因系（ 等 ；（ 2）临时性作图群体 ， 包括 其衍生的 系、回交群体等。到目前为止，使用过的 图方法主要有：单标记作图法、区间作图法、复合区间作图法、混合线形模型法和 析法等。其作图的一般步骤包括：分离群体的构建；分子标记连锁图的绘制；分离群体数量性状的考察和标记基因型的检测；标记基因型和数量性状值之间的相关性分析，确定 染色体上的相对位置，并分析其效应的大小。 近几年来，随着分子标记的 大量开发 ， 图技术取得了飞 速发展 。 就小麦而言，其基因组出现的分子标记遗传连锁图越来越精密（ et 1998; et 2000; et 2003; et 2004; et 2004; et 2005）；同时，构建的作图群体 数量 越来越多，种类也多样化，除了传统的 体 、 回交群体、重组近交系、加倍单倍体群体、回交近交系和近等基因系外，开始出现了渐渗系（ 作 图群体（ 2003）。 另外， 图涉及的农艺性状不仅包括产量（ et 2002; et 2003）、品质（ et 1998; et 2000; et 2000; et 200