单克隆抗体的制备及应用

.,单克隆抗体的制备及应用,西南大学,目录,5展望,.,单克隆抗体的简介,1第一部分,单克隆抗体的简介,1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术。他们把可在体外培养和无限增殖的骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体的特点。这种杂交瘤，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（mAbs），简称单抗。,.,单克隆抗体技术的发展经历,2第二部分,鼠源性单克隆抗体,嵌合性单克隆抗体,人源化单克隆抗体,全人源单克隆抗体,鼠源性单克隆抗体是来源于鼠蛋白，因此对于人体而言是外来物从而易被抵抗。,嵌合性单克隆抗体是指同时具有人和鼠的来源构成，通常是30%比70%。鼠源部分用来结合抗原，人源部分用来诱导产生疗效。,人源化抗体就是指抗体的可变区部分或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。,其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。,单克隆抗体技术发展经历,.,单克隆抗体的制备,3第三部分,单克隆抗的制备,动物免疫,1,1,2,3,4,细胞融合和选择性培养,杂交瘤细胞的筛选及克隆化,大量制备及纯化,单克隆抗体制备的简易流程,动物免疫,抗原制备：制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，同时应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。,免疫动物的选择：一般的杂交瘤生产都选用BALB/c小鼠或LOU/c大鼠作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。,免疫程序的确定：在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。,目前常用的免疫程序,细胞融合和选择性培养,融合过程中，常采用聚乙二醇（PEG）作为融合诱导剂。PEG促进细胞融合的机制可能是与临近细胞膜的水分相结合使细胞间的水分被取代，降低细胞表面的极性，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞膜的融合。注意：PEG的分子量和浓度与融合效果相关，PEG的分子量越大，浓度越高，其促融率也越高，但其粘度和细胞的毒性也随之增大；浓度低于30时，融合率低。,HAT选择性培养1964年Littlefield首先发明了HAT(HHypoxanthine次黄嘌呤，AAminopterin甲氨喋呤，TThymidine胸腺嘧啶核苷)选择性培养。HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的。,.,细胞内DNA的生物合成途径,主要生物合成途径,补救途径,甲氨喋呤,次黄嘌呤,次黄嘌呤核苷酸,HGPRT+,TK+,胸腺嘧啶,胸腺嘧啶脱氧核苷酸,DNA,利用糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA,叶酸拮抗物氨基蝶呤可阻断主要途径,.,小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞（Sp2/0）融合后的细胞在HAT选择培养基中结局,Sp2/0,+,B,Sp2/0,Sp2/0,B,B,Sp2/0,B,死亡,死亡,存活,杂交瘤细胞的筛选及克隆化,克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染,.,3,3,3,2,4,4,4,4,4,2,2,2,4,4,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,有限稀释法,大量制备及纯化,大量制备,纯化方法1、盐析2、凝胶过滤3、离子交换层析4、亲和层析法,盐析：用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。,血清50%饱和度硫酸胺上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%饱和度硫酸胺上清沉淀拟球蛋白r球蛋白,凝胶过滤法：干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入。胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。交联葡聚糖凝胶(Sephadex）琼脂糖凝胶(Sepharose),离子交换层析法DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂,将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。A蛋白-SepharoseCL4B,亲和层析法：,.,单克隆抗体的应用,4第四部分,作为生物治疗的导向武器,作为免疫抑制剂,作为研究工作中的探针,增强抗原的免疫原性,检验医学诊断试剂,农兽药的快速检测,作为亲和层系的配体,单克隆抗体的应用,作为亲和层系的配体,单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，固定在层析柱上，通过亲和层析，即可从复杂的混合物中分离、纯化这一特定成分。优点：与其他提取方法相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。,蛋白质提纯,先用待提纯蛋白质制成单抗，再将单抗固定在惰性固相基质上，制成层析柱。而后倒入混合液，当混合液流经单抗时，相应的蛋白质与单抗特异性结合，杂质则随洗脱剂流走。再用特殊的洗脱剂将蛋白质洗脱下来，则可将蛋白质提纯。,在亲和层析中单克隆抗体是主要的配体,作为生物治疗的导向武器,以抗肿瘤为例：将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。,常见抗肿瘤细胞毒剂：化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。,作为免疫抑制剂,抗人T淋巴细胞单抗（McAb）作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应，其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。例子：对于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能够减轻移植物抗宿主病的发生。,作为研究工作中的探针,利用单克隆抗体的特性可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能关系，进而可以从理论上阐明其机理。例子：用荧光物质标记单抗作为探针，能快速地确定与其结合的相应生物大分子在细胞中的位置和分布。,增强抗原的免疫原性,将单抗制成佐剂加在疫苗里，则可减少疫苗接种时药物的用量和避免多次接种并不能引起机体更好地产生免疫应答，从而减少疫苗接种的风险。佐剂的作用机理：,细胞因子的测定,激素测定,肿瘤抗原的检测,免疫细胞及其亚群的的检测,病原微生物抗原、抗体的检测,检验医学诊断试剂,农兽药快速检测,农兽药属于小分子物质，半抗原，无免疫原性，不能刺激动物产生抗体，必须先将其制备成人工抗原，以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反应，从而制备出对该农药具特异性的多或单克隆抗体国外已制备多种农兽