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文档简介

DHPLC变性高效液相色谱在突变基因中的应用,1.神马是液相色谱,液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用,神马是高效液相色谱,高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相。,液相色谱法原理,分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。,HPLC的极性分离类型,液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱(NP-HPLC)采用极性固定相，流动相为相对非极性的疏水性溶剂常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱(RP-HPLC)重点采用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。比如高通量筛选DNA序列变异。,反向液相色谱流筛选基因变异流程程图,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,溶剂,数据处理,溶剂,DNA:非极性物质色谱柱:非极性溶剂:极性水/甲醇/乙腈,柱塞往复泵,手动进样器,独特的DNA色谱柱DNASep柱,当DNA片段遇见PS-DVB和TEAA,杂合子个体的DNA经扩增产生杂合二倍体,它与纯合子个体的DNA扩增产物完全匹配的纯合二倍体的解链特征不同,在部分加热变性的条件下,通过杂合与纯合二倍体于柱中的保留时间差异,而发现DNA的突变。当柱温升高使DNA片段开始变性,则部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链(错配的)DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因有错配区的存在而更易变性,被色谱柱保留时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。,同源DNA于异源DNA,DHPLC系统和琼脂糖凝胶电泳对Hae3酶切质粒pUC18分析图谱比较,紫外光检测器,DHPLC在检测突变基因的主要技术特点,检测的准确性高,对未知突变大于96%,已知突变大于99%。检测灵敏度高,能检测低水平的突变,可靠检测样品中少至5%的基因型。可分析异质性样本,可进行混合样品的分离检测。操作容易,自动化分析。结果重复性高,速度快。,DHPLC在微生物领域的应用,DHPLC
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