DNA合成原理及操作ppt课件

.,DNA合成原理及操作规范,.,.,合成原理,DNA通过固相亚磷酰胺三酯法合成：溶液中的亚磷酰胺单体通过缩合反应形成3-5磷酸二酯键，连接到固相载体（CPG或树脂）上。并依次延伸，直到序列的最后一个5碱基连接上后合成结束。整个合成过程仪器自动完成，每个循环分为脱保护、活化、偶合、盖帽（封闭）、氧化五个步骤。,.,第一步：脱保护（Deblocking）:用三氯乙酸（TCA）去除CPG所链核苷上的DMT保护基团，暴露5羟基，供下一步缩合。第二步：活化（Activation）：单体与催化剂四唑混合进入合成柱，四唑转移一个质子给3亚磷酸上二异丙胺基的N原子，质子化的氨是四唑亲核进攻的离去基团，二异丙酰胺被四唑取代，形成亚磷酰胺-四唑活性中间体。,.,第三步：偶合（Coupling）:亚磷酰胺-四唑中间体与CPG所连接的核苷酸的5羟基发生缩合反应，缩合脱掉四唑，形成延长一个碱基的核苷酸链。第四步：盖帽（Capping）:少量未反应（2%）的载体上的核苷酸链的5羟基会在后续的循环中参加反应，生成少一个碱基的核苷酸链，因此需要在反应后进行封闭。常用乙酰化反应与5羟基缩合成酯键，一般用混合乙酸酐和N-甲基咪唑等做乙酰化试剂。,.,第五步：氧化（Oxidation）:偶合反应形成的三价亚磷酸酯键很不稳定，因此要用氧化剂碘的四氢呋喃溶液将三价磷氧化成稳定的五价磷。依此步骤循环，最终得到一个全长DNA片段粗品。用新鲜的浓氨水把粗品从载体上切割下来，采用适当的纯化方式去除短片段和氨基脱保护及氰乙基脱保护形成的盐离子。,.,DNA合成作业流程,1.接收订单安排合成合成部根据合成实际情况合理安排订单，依次安排加急-测序-内部-外部，同一客户尽量同批次安排合成，部分长链、G含量高、合成量大的引物比较难合成，时间上可能会有所延缓2.上机合成不同型号的合成仪合成通量和合成时间均不同，公司预定的仪器批次合成96条引物，20bp长度合成需要2-3小时。,.,3.氨解脱保护合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。一般40bp以内至少需要2小时，链越长需要时间越长。4.纯化:目前惯用的纯化方式主要有4种：OPC纯化、PAGE纯化、脱盐纯化、HPLC纯化,.,4.1OPC纯化利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml的20%乙腈洗脱。优点：方便，快捷，纯化后纯度可达90%，能满足普通PCR反应。缺点：纯化成功与否取决于粗品DNA的纯度，合成不好的样品可能OPC纯化后也不纯，并且随着碱基数增多，纯化效果降低；由于在纯化过程中接触到酸，引物容易降解。,.,4.2PAGE纯化利用DNA不同片段在胶中迁移率不同而分离，大片段电荷多，分子大，迁移的速度慢。等目的片段与N-片段分开后切下目的片段，80孵育2小时后脱盐。优点：分离效果好，纯度能达到98-99%，可以满足测序、克隆等用。引物也很稳定。缺点：比较费时费力，样品损失很大。,.,4.3脱盐纯化如果偶合效率高，合成效果好，粗品本身没有什么短片段，可以直接脱盐。优点：省去PAGE电泳的麻烦，样品回收率高。缺点：不能有效去短片段，前提一定要合成效果很好才选用此方法。,.,4.4HPLC纯化HPLC吸附基质分反相柱和离子柱：RP(反相柱）是根据疏水性的差别来分离的：疏水性更强的长片段比短片段在柱内保留的时间更长。离子柱是根据不同长度的寡核苷酸带有不同的净电荷，通过缓慢增加流动相的离子强度将n-片段先洗脱。优点：纯化效果好，纯度可达99%以上，特别是对标记引物，特殊探针特别有用。缺点：不能批次生产，比较费时，有时样品接收不好也不能有效分离。,.,5.样品定量分装样品纯化后洗脱在1ml的20%乙腈溶液里，260紫外波长下测值，根据客户要求分装，一般所有合成公司基本都会按1.2-1.5倍放大给量。分装的样品干燥，经PAGE抽样检测合格后交给市场。,.,合成时效：批次引物（按24条计算）在24小时之内可以出货通常合成一批20bp左右的引物：OPC纯化：12小时之内合成2-3小时氨解2小时OPC纯化（一批24条）1小时定量分装1小时抽干1-2小时抽检2小时PAGE纯化：16-19小时合成2-3小时氨解2小时抽干2-3小时电泳切胶2-3小时泡胶2小时脱盐0.5小时定量分装1小时抽干2-3小时抽检2小时脱盐纯化：12-15小时合成2-3小时氨解2小时抽干2-3小时脱盐0.5小时定量分装1小时抽干2-3小时抽检2小时,.,DNA合成中碱基缺失或错误原因分析,一般客户提出异议时，我们首先给客户重新合成，然后再分析原因。从合成机理上分析就可以很清楚的表明：人为的因素不可能造成碱基缺失或个别的碱基错误。如果说某一个碱基由于种种原因(如瓶中溶液没有了，或管道堵塞)，未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一个反应Capping将会把Oligo封死，使整个oligo合成立即中止。造成的原因可能是：1、Taq酶的原因。因为在PCR扩增时引物也被扩增,就可能出现错误，2、化学原因。在合成过程中，如果本公司提供的DNA合成报告单是正确的，表示合成是成功的。化学合成的DNA片段要比天然的DNA片段有更多的碱基突变概率。但其真正的化学机理还不太清楚，但可以肯定的是要保证100不发生错误是不可能的。解决的办法：1、采用高保真的Taq酶2、重新挑克隆3、重合引物,.,DNA损伤,一、碱基脱落形成AP位点热和酸等都可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落，形成AP位点（ApurinicorApyrimidinicsite）。烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上无碱基的位点。二、碱基的改变物理因素：电离辐射可引起其它物质产生自由基，从而引起碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。化学因素a.烷化剂硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯（MMS）等烷化剂可将烷基加到嘌呤或嘧啶的N或O上使碱基烷基化。鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击，形成m7G和m3A烷基化的嘌呤碱基，导致复制时碱基错配。例如鸟嘌呤N7被烷化后会与T配对，结果会使G-C转变成A-T。b.碱基类似物5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。它们的结构与碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成。如5-BU与T结构相似，在酮式结构时与A配对；它更易成为烯醇式结构与G配对，在DNA复制时导致A-T转换为G-C。,.,c.黄曲霉素黄曲霉素B、1,2-乙酰-氨基芴、苯并芘、吖啶等可插入碱基序列，引起移码。d.硝酸盐亚硝酸盐能使C脱氨变成U，经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T对。碱基的自发改变和损伤a.碱基的异构互变4种碱基各自的异构体间都可自发地互变（烯醇式与酮式间的互变），这会使碱基间发生错配，使A-C、T-G等。b.碱基的脱氨基作用碱基的环外NH2有时会自发脱落，使CU、A次黄嘌呤（I）、G黄嘌呤（X）等，DNA复制时，U-A、I-X、I-C配对，导致子代DNA序列错误。5-甲基胞嘧啶脱氨基产生T（引起C-GT-A的变化），而C脱氨基产生U（它通常被移出或被C代替）。氧自由基伤害细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。,.,三、碱基插入或缺失吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插入一个碱基。DNA聚合酶在复制过程中发生滑动，尤其在连续几个相同碱基的区段产生1个或几个碱基的缺失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺失，在生长链上滑动易于造成插入。插入或缺失会导致读码框改变。,.,四、嘧啶二聚体DNA受到紫外线照射时，使DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体。相邻2个T；或