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第六届“挑战杯”广东省大学生课外学术科技作品竞赛获奖作品阳东县马铃薯病毒病田间调查及病毒基因克隆、序列分析、RT-PCR检测许东林 蔡艳清摘 要：广东省阳东县大田马铃薯植株发生典型的卷叶病毒病症状，其株发病率为31.5%69.0%。采用RT-PCR反应对从病叶组织中提取的总RNA进行扩增，再对扩增产物DNA进行克隆及序列测定，并根据所测DNA序列中一个长为627bp的开读框（编码208个氨基酸）确认其为马铃薯卷叶病毒（PLRV）的外壳蛋白（CP）基因。比较表明，PLRV阳东分离物CP基因与已报道的法国Noir株系、中国河北分离物、中国福建分离物、南非分离物等的CP基因高度同源，其核苷酸序列的同源率分别为100%、100%、99%、96%。同源率比较的结果可用于推测PLRV的可能传播渠道。本研究设计并合成了4对寡聚核苷酸引物，从中筛选出了一个最佳引物对（P1: 5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3及P2-1: 5-GGAACTTGTTGACGTAGGAC-3）， 经一步法RT-PCR能够准确、 高灵敏度地对病叶组织中PLRV进行快速检测。对阳东县的种薯进行RT-PCR检测发现，有60%的种薯带有PLRV，由此证实了种薯带毒。关键词：马铃薯卷叶病毒；外壳蛋白基因；分子检测；RT-PCR马铃薯在种植生长过程中可受到多种病毒侵染，各种病毒在种薯中不断积累，经无性繁殖数代后，种薯几乎会100带病毒，由此造成马铃薯产量逐年下降，品质变劣，“种性退化”，损失巨大1，3。目前马铃薯病毒病的主要防治措施是种植无毒种薯。而在种薯的脱毒生产中，对其进行病毒检测以确定所生产的种薯是否带病毒，是一道重要的工序。研究马铃薯病毒的检测和鉴定技术，对马铃薯生产有着重要的意义。本研究对广东省阳东县的马铃薯病毒病进行了田间调查，并对其主要病原马铃薯卷叶病毒(PLRV) 外壳蛋白基因进行了克隆、序列分析，建立了PLRV 的RT-PCR检测方法，对该县种薯带病毒情况进行了检测。1 田间调查2002年秋末，广东省阳东县大沟镇、雅韶镇等地利用水稻冬闲田种植马铃薯，在其生长早期即发现部分植株生长异常，至生长中期表现出明显的病毒病症状。因此我们于2003年1月27日对上述两镇种植的马铃薯进行了田间病情调查。1.1 病株症状表现发病植株大多黄化、矮化、僵直，生长不良。大部分病株下部叶片向上卷曲，直至呈筒状，而上部叶片形状基本正常。严重者整株叶片卷曲成筒状。卷曲的病叶变得僵硬，手握可发出如纸片磨擦般的响声。部分病叶沿叶脉变褐，呈褐色网纹状；少数病叶有褐色斑点。部分病株叶柄及茎杆有褐色条斑。各类型症状见附录I。1.2 病株田间分布病株在田间呈随机分布，没有明显的发病中心，田块边缘和田块中央没有发病率的差异。1.3 不同田块株发病率对阳东县2个镇连片种植的马铃薯田块进行了调查，结果见表1。在所调查的6块田中，所有田块均有病毒病发生，株发病率为31.569.0%，田块间发病率差异主要是由肥水管理差异所造成的。表1. 阳东县马铃薯病毒病田间株发病率调查（2003年1月27日，生长中期）调查地点连片种植面积（亩）调查类型田病株率（病株数/调查株数）大沟镇新梨洞村500长势较差402%（172/410）长势较好396%（120/303）长势良好318%（96/302）长势中等690%（181/263）雅韶镇200长势良好315%（252/801）长势差417%（263/631）1.4 初步诊断与已有资料2对比，被调查的马铃薯病株大多呈现典型的卷叶病毒病症状。由于田间发病早，病株率较高，病株田间分布为分散型，没有明显的发病中心；种植田周边也不具备大面积的马铃薯卷叶病毒转主寄主（番茄、烟草等）作物。据此初步判断广东省阳东县马铃薯可能是受到种薯传带的马铃薯卷叶病毒（potato leaf roll virus, PLRV）为害。为了进一步确证病毒病原及种薯带毒情况，我们进行了病毒基因分析及种薯带毒分子检测试验。2 病毒基因克隆及序列分析根据田间调查结果，可以推测广东省阳东县马铃薯病毒病可能是由马铃薯卷叶病毒（PLRV）引起的。由于PLRV不能经机械摩擦传播，寄主范围较窄（除马铃薯外，只能侵染番茄、烟草等少数几种植物），通过寄主范围测定法很难对其进行鉴定；PLRV仅存在于寄主植物的韧皮部，感病植物体内的病毒含量非常低，血清学方法也很难对其进行诊断鉴定1，3。为了确定该病的病原，并获得有关此病原更详细的资料，我们对发病植株体内病毒基因进行了克隆和序列分析。 2.1材料与方法211 引物设计与合成因为PLRV外壳蛋白（coat protein, CP）基因最为保守，我们根据基因数据库（GenBank）已报道的PLRV基因组序列，在病毒CP基因两侧设计和合成（交由大连宝生物工程公司合成）了DNA引物，上游引物P1：5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3，下游引物P2：5-AGTTCTGGTTCTCGTCCTC-3，以扩增PLRV CP基因，预期扩增DNA片段长度为960bp。212 样品制备采集表现典型卷叶症状的病株上部初卷叶片，采用UNOQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）抽提叶组织总RNA，以健康无症植株叶片为对照。具体步骤为：剪取50mg病叶组织，置于研钵中，加入适量液氮研磨成粉状，加入0.5ml Trizol溶液，稍作研磨，研磨液转入1.5ml离心管中，加300l氯仿异戊醇（241），充分振荡，12,000rpm离心5min，取上清液转入无菌无RNA酶污染的1.5ml离心管中，加1/3体积无水乙醇，混匀，将全部溶液转入套放于收集管内的UNOQ-10柱中，室温放置2分钟，8,000rpm离心1分钟，小心取出UNOQ-10柱，弃去收集管中的废液，将UNOQ-10柱放回收集管中，加入450l RPE溶液，10,000rpm离心30秒，小心取出UNOQ-10柱，弃去收集管中的废液，将UNOQ-10柱放回收集管中，10,000rpm离心15秒，小心取出UNOQ-10柱，将其放入到无菌无RNA酶污染的1.5ml离心管中，在柱内膜的中央小心加入50l 无RNA酶污染的水，室温放置2分钟，10,000rpm离心1分钟，离心管内的溶液即为RNA样品液。立即使用或置-70贮存备用。213 RT-PCR反应RT-PCR反应采用TaKaRa one step RNA PCR kit(AMV)进行，25l反应体积内含RNA样品液1l，10buffer 2.5l，25mmol/L MgCl2 5l，10mmol/L dNTPs 2.5l，Rnase inhibitor(40U/l )0.5l，AMV-Optimized Taq 0.5l，AMV RtaseXL(5 U/l )0.5l，引物P1、P2各1l，补无RNA酶污染的双蒸水至25l，反应液上覆盖石蜡油15l，置于Biometra公司UNO热循环仪上按下述程序进行反应：47反转录30min；942min灭活反转录酶；940.5min，55 0.5min，72 1.5 min，30个循环；72延伸10 min。214 RT-PCR产物电泳及回收取RT-PCR反应产物10l，加2l 6上样缓冲液（0.25%溴酚兰，40蔗糖水溶液），混匀，点入1.2琼脂糖凝胶（含0.5g/ml EB）上样孔中,以2，000bp ladder DNA ( Biolabs 公司产品)为分子量标准，用0.5TBE缓冲液（0.045 mmol/L Tris-硼酸，1.0 mmol/L EDTA，pH8.0）在5V/cm电场强度下电泳约1hr，于UVP凝胶成像系统观察和照相。根据分子量大小判断目的片段，并切胶回收其中的DNA分子。采用上海生工生物工程技术服务有限公司 提供的试剂盒回收DNA。215 RT-PCR产物克隆及测序电泳回收的DNA分子克隆于pMD 18-T载体，采用双脱氧链末端终止法用M13-47（5-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3）和RV-M（5-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3）引物分别从两端在ABI PRISMTM377XL DNA测序仪上对重组质粒进行测序，克隆和测序交由大连宝生物工程有限公司进行。22 结果与分析221 RT-PCR产物电泳结果病叶总RNA抽提液经RT-PCR反应均能获得预期大小的DNA电泳带，不同样品电泳带强弱存在差异，可能与样品抽提质量有关。健康植株对照样品无任何扩增电泳带（见图1）。 1 2 3 4 5 6 7 8图1. 引物P1、P2对马铃薯卷叶病株叶组织总RNA RT-PCR产物电泳结果1:健叶对照, 2,3,4,5,6,7:病叶总RNA扩增产物, 8:DNA分子量标准222 RT-PCR产物克隆测序结果测序结果表明，所获得的RT-PCR产物全长960bp，所克隆片段的正义链核苷酸序列如下：C,CTCGTTACAT,CAACCGGACA,AAATAGATTA,TAAATTCTTA,GCGGGATTTG,CTTTAGGATT,TTCATCCGCA,ATCCCATTTT,CAGTAGCCGG,TTTATATTTT,GTTTACCTAA,AGATTTCCTC,CCACGTGCGA,TCAATTGTTA,ATGAGTACGG,TCGTGGTTAA,AGGAAATGTC,AATGGTGGTG,TACAACAACC,AAGAAGGCGA,AGAAGGCAAT,CCCTTCGCAG,CGCGCTAAC,AGAGTTCAGC,CAGTGGTTAT,GGTCACGGCC,CCTGGGCAAC,CCAGGCGCCG,AAGACGTAGA,AGAGGAGGCA,ATCGCCGCTC,AAGAAGAACT,GGAGTTCCCC,GAGGACGAGG,CTCAAGCGAG,ACATTCGTGT,TTACAAAGGA,CAACCTCATG,GGCAACTCCC,AGGAAGTTT,CACCTTCGGG,CCGAGTCTAT,CAGACTGTCC,GGCATTCAAG,GATGGAATAC,TCAAGGCCTA,CCATGAGTAT,AAGATCACAA,GCATCTTACT,TCAGTTCGTC,GCGAGGCCT,CTTCCACCTC,CTCCGGCTCC,ATCGCTTATG,AGTTGGACCC,CCATTGCAAA,GTATCATCCC,TCCAGTCCTA,CGTCAACAAG,TTCCAAATTA,CGAAGGGCGG,CGCCAAAACT,TATCAAGCGC,GGATGATAAA,CGGGGTAGAA,TGGCACGATT,CTTCTGAGGA,TCAGTGCCGG,ATACTGTGGA,AGGGAAATGG,AAAATCTTCA,GATACCGCAG,GATCCTTCAG,AGTCACCATC,AGGGTGGCTT,TGCAAAACCC,CAAATAGGTA,GACTCCGGAT,CAGAGCCTGG,TCCAAGCCCA,CAACCAACAC,CCACTCCAAC,TCCCCAGAAA,CACGAGCGAT,TTATTGCTTA,CGTTGGCATA,CCTATGCTAA,CCATTCAGGC,CAGGGAGAAC,GATGACCAAA,TCATATTGGG,TTCCTTAGGG,AACCAAAGGA,TGAAATATAT,AGAGGACGAG,ACCAGAACT 可见第142位有一个翻译起始密码ATG，第767位有一个翻译终止密码TAG，构成了一个627bp的开读框，该开读框推导产生208个氨基酸残基的蛋白质产物。该开读框即为马铃薯卷叶病毒外壳蛋白（coat protein, 简称CP）基因。223 马铃薯卷叶病毒阳东分离物CP基因序列分析由测序结果可知，我们从阳东县马铃薯病株组织中克隆到了马铃薯卷叶病毒 CP基因，因而将发生于阳东县的马铃薯病毒命名为PLRV阳东分离物。将所测定的PLRV阳东分离物CP基因序列与基因数据库（GenBank）中已报道的基因序列进行比较，结果表明，PLRV阳东分离物CP基因与世界各地已报道的PLRV各株系或分离物CP基因高度同源：与分离自法国的Noir株系及中国河北张家口分离物完全相同；与中国福建分离物部分序列同源率为99%（611/617）；与南非分离物同源率最低，为96%(608/627)。表2列出了几个具代表性株系或分离物的比较结果。表2. PLRV阳东分离物与部分已报道的PLRV株系或分离物CP基因序列同源性比较PLRV株系或分离物NoirZhamgjiakouFujian CanadianCU87Zim13V4AustalianSouth Africa地理来源法国中国中国加拿大古巴津巴布韦苏格兰澳大利亚南非与阳东分离物同源率100100*99999999989796*文献报道的张家口分离物与阳东分离物存在1个核苷酸差异，但该核苷酸是由该文献的作者通过PCR引物人为引入的，因此我们不认为其为真实差异。3 马铃薯卷叶病毒分子检测通过对病毒基因序列的分析，我们确定引起阳东县马铃薯病毒病的主要病原为PLRV，而种薯带毒是其主要传播方式之一，为此我们建立了PLRV分子检测技术并对部分种薯进行了检测。3. 1 检测方法的建立311 RT-PCR引物的设计与合成根据所测定的PLRV阳东分离物CP基因及其上、下游核苷酸序列，设计并合成了4条寡聚核苷酸引物，分别组成4个引物对，用以对PLRV基因组相应片段进行扩增。引物所在位置、序列及其预期扩增片段大小如下：P1-1P2-1P2P1CP基因图2 PLRV RT-PCR检测引物设计其中：P1：5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3P1-1：5-GAGTTCAGCCAGTGGTTATG-3P2：5-AGTTCTGGTTCTCGTCCTC-3P2-1：5-GGAACTTGTTGACGTAGGAC-34条引物共组成4个引物对，其预期扩增片段大小为P1P2： 960bpP1P2-1： 584bpP1-1P2： 728bpP1-1P2-1： 362bp312 RT-PCR检测最佳引物对筛选样品处理、RT-PCR扩增及产物电泳均按2.1.2、2.1.3、2.1.4所述进行。用病叶组织总RNA抽提液为模板，采用不同的引物对进行RT-PCR扩增，结果见图3。由图3可知，所设计的4对引物都能扩增PLRV目的片段，但引物对P1-1P2及P1P2产物量太少(泳道2,4)，易受样品质量影响 1 2 3 4 5 图3. 不同引物对扩增PLRV基因组相应片段的效果泳道1,2,3,4:分别为引物对P1-1P2-1,P1-1P2,P1P2-1,P1P2扩增产物; 泳道5:DNA分子量标准（见图1）；引物对P1-1P2-1有一些较弱的非目的片段扩增产物(泳道1)；引物对P1P2-1产物电泳带最为单一、明亮(泳道3)，适合用做病毒检测。313 引物对P1与P2-1检测PLRV的灵敏度将病株叶片总RNA抽提样品用无RNA酶污染的双蒸水进行10倍系列稀释，用不同稀释度的RNA抽提液为模板，以P1、P2-1为引物进行RT-PCR扩增。结果（图4）表明，引物对P1与P2-1检测PLRV的灵敏度为10-5总RNA抽提液，相当于可检出10-5mg（十万分之一毫克）马铃薯病叶组织中所含的病毒。32 种薯样品的处理及检测321 种薯的处理马铃薯种薯由阳东县农业局提供。取种薯块茎用自来水洗净，按芽眼切成适度大小的薯块，每个种薯取一个薯块，播种于磁盘里河沙中，置于光照培养箱中28每天12小时光照保湿培养，约2-3周后马铃薯幼苗长出4-6片叶，取幼嫩的平展叶片进行病毒检测。322 样品检测结果按照前述方法抽提样品组织总RNA，以引物P1、P2-1进行RT-PCR扩增，电泳结果表明，在所检测的30个样品中，有18个样品发生了目的片段扩增（见图5），也即在60%的种薯中检测到了马铃薯卷叶病毒。 1 2 3 4 5 6 7 8图4. 引物对P1、P2检测马铃薯病毒叶中PLRV的灵敏度1. 7: 病叶总RNA抽提液稀释10-6, 10-5,10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 100扩增产物, 8: DNA分子量标准1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16图5. 马铃薯种薯携带PLRV检测结果1- 15泳道:样品扩增产物, 16泳道:DNA分子量标准4 结论与讨论4.1 田间调查显示，广东省阳东县大田种植的马铃薯30%以上的植株表现出典型的卷叶病毒病症状，严重田块病株率接近70%。病株在田间呈随机分布。田块之间的病株率存在差异，可能与管理水平的不同有关。 4.2利用基因克隆及序列分析的方法，确认该病的病原为马铃薯卷叶病毒（PLRV）。 4.3为了建立PLRV的RT-PCR分子检测技术，设计与合成了4对寡聚核苷酸引物，经一步法RT-PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，表明引物对P1: 5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3与P2-1: 5-GGAACTTGTTGACGTAGGAC-3的检测效果最佳。该引物对检测PLRV的灵敏度为10-5mg病叶组织中的病毒，RT-PCR产物呈明亮的单一电泳条带。 4.4从病株症状、田间分布、发病时间及发病率等调查结果推断该病的发生极可能是播种带毒种薯所致。我们采用RT-PCR检测技术，对阳东县农业局提供的马铃薯块茎（经培养长出幼叶）进行检测，结果发现60%的种薯带有PLRV，证实了以上推断。 4.5 基因序列分析揭示，阳东县PLRV CP基因与分离自法国的Noir株系以及我国河北张家口分离物完全相同；而与我