血脂各个项目的不同测定方法.doc

血清脂类测定血浆中的脂类包括胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。目前，对有关脂类代谢疾患的诊断和治疗过程，均必须检测血浆（清）中的脂类，通过其含量的变化，对临床疾患提供协助诊断的依据。有关医学科研工作，脂类的定量检测也是一项必备的研究项目。1胆固醇测定血浆中胆固醇及其酯的含量检测，从方法学上可分为两大类：一类是化学法包括抽提法和直接测定法，这类方法目前仍在沿用；另一类是酶法测定，方法敏感特异快速，并能自动化分析，已常规应用。化学测定法种类多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定的差异。目前公认的参考方法是Abell-Kendall(L-B反应)法。另外，三氯化铁-硫酸反应法（Zak法）具有显色稳定法、操作简便、灵敏度约5倍于L-B反应法，胆固醇酯与游离胆固醇显色程度比较接近等优点，缺点是特异性差，干扰因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血清样品中的血红蛋白，胆红素以及硫酸的质量等因素均可影响Zak方法的准确性，Zak法更适合于科研使用。酶法测定血清胆固醇的方法已被广泛采用，国产试剂已能满足临床的需要。胆固醇测定用的标准品，按美国国家标准局（NBS）出品纯度达99.8%,是国际公认的参考物，国内李健斋等已纯化制成符合这一要求的胆固醇纯品，已供临床检测血清胆固醇使用。2甘油三酯测定血浆甘油三酯的测定，目前多以化学法和酶法定量。化学法测定甘油三酯是以脂蛋白变性，水解成甘油，并以甘油为计算依据。酶法是以特异酶水解甘油三酯，除去脂肪酸，再测定甘油，方法特异，准确而快速，临床广为应用。目前甘油三酯测定的方法主要以定量甘油为依据，然而血清样品中存在有游离甘油，如何从反应过程中的总甘油中减去游离甘油，多年来一直在研究讨论这一问题。若不减去，其测定值将会高于血清样品中的真值，如果要减去，就必须先测出血清样品中的游离甘油，甘油三酯的测定方法将增加一个繁杂的步骤，实际工作中难以做到。有报道血清样品中的游离甘油实际量是0.070.13mmol/L，相当于甘油三酯的0.56.0mmol/L，为此建议，实测的甘油三酯量减去一个校正系数即：甘油三酯（mmol/L）=0.98总甘油（mmol/L）-0.07（mmol/L）。这一校正系数也仅适用于健康人，对临床病人并不一定适用。据报道，血清样品的游离甘油一直是个未知数，无法测准。为此，目前临床测定血清甘油三酯时，基本上未考虑游离甘油，因为其含量很少，暂且忽略不记。甘油三酯测定的参考物，推荐三油酸甘油酯和三软脂酸甘油酯混合物（2：1，W/W），此参考物适用于化学法。在酶法测定中，仍以高纯度的三油酸甘油酯为参考物。3磷脂测定血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂、脑磷脂和其他少量磷脂。如需要分别检测各种磷脂，可以通过薄层层析法、柱层析法和高压液相色谱法。目前，临床仅测定血清磷脂总量。血清磷脂总量的测定方法有化学方法和酶法两大类。化学法是以磷脂中的磷为定量依据，因为每磷脂分子中都含有一个磷酸根，故将磷脂的磷称为脂性磷。由于血清中磷脂大部分为卵磷脂，其分子量中磷约占4%，故将脂性磷换算成磷脂的系数，一般为25。由于化学法均需要抽提，再测抽提液中的磷脂的磷，血清中的磷酸盐不可能混入抽提液中，因此血清中的磷酸盐对磷脂测定的干扰很少。酶法是利用磷脂酶进行定量测定。生物体中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四种。磷脂酶D特异性差，均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神经磷脂，三者约占血清总磷脂的95%，临床多用含磷脂酶D 的试剂进行磷脂的定量测定。4游离脂肪酸测定游离脂肪酸属于未酯化的一类脂肪酸，故又称为非酯化脂肪酸，其量很少，采用方法必须是灵敏的方法，还需要避免脂肪水解产生脂肪酸的干扰。测定方法有：滴定法需要微量滴定装置，因为要通过肉眼观察颜色，难免会有主观因素的影响，所以难以测定准确，很难用于常规；光度法，以铜皂法常用；酶法，主要采用特异性不强的脂肪酶D进行检测，方法特异，快速准确，已常规应用于临床。第一节 胆固醇测定血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸（43%）、油酸（24%）、软脂酸（10%）、亚麻油酸（6%）、花生四烯酸（6%）、硬脂酸（3%）等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。1化学法化学法一般包括：抽提；皂化；毛地黄皂苷沉淀纯化；显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过步骤操作过程。常规操作中多采用省去了、。或者用省去、步骤的Zak-Henly法及省去步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。2酵法测定CE在胆固醇酯酶（cholesterol esterase）作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase,COD）氧化成4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。一、Abell-Kendall改良法1原理血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。2试剂组成代号种类浓度组 成贮存28有效时间R1乙醇优质纯R2石油醚沸点68，特级纯R3水醋酸分析纯R4无水醋酸胆固醇分析用，不含HCIR5浓硫酸分析纯R6KOH液33%(W/W)KOH10g+H2O 20mlR7乙醇性KOH液R194ml+R66ml临用前配制R8Liebermann配制后BurchardR420体积+R51体积+R310体积1h试剂*内用完R9胆固醇标准液5.17mmol/L胆固醇标准品200mg+R1100ml0*：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。3操作 图15-1 血清胆固醇（Abell法）测定操作图4计算标准总胆固醇浓度=ESA/EST5.17(mmol/L)二、酶法（CEH、COD-POD法）首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶（CEH）水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）作用下，生成4-胆甾烯酮和H2O2，再H2O2经过氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS）参与下，生成红色醌亚胺色素。H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林红色醌亚胺色素（一）手工测定法1试剂组成代号种类浓度组成贮28有效时间Na2HPO450mmol/LNa2H2PO450mmol/L胆酸钠3mmol/L4-氨基安替比林0.82mmol/LR1*ESPAS14mmol/L24hCarbowax-60000.17mmol/LCEH33U/LCOD117U/LPOD6700U/LR2标准液5.17mmol/L用异丙醇溶解胆固醇*混匀，调pH至6.700.10(25)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。2操作按图15-2操作。3计算标准总胆固醇浓度=ESA/EST5.17(mmol/L)（二）自动化分析仪测定以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。1试剂组成A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。B液：COD、4-氨基安替比林等。图15-2 血清胆固醇测定（酶法）操作图2上机参数项 目参 数方 法终点法波 长双波长（540nm，700nm）反应温度3