第七章生物化学制药ppt课件

第七章生物化学制药一 概述二 生化药物制备技术三 生化药物制备实例 生化药物 所谓生化药物是指以天然的动物 植物 微生物等生物体组织和器官为原料 通过化学方法进行提取 精制或者用化工合成方法制成的内源性生理生化物质 用于预防 治疗 诊断疾病 包括由上述这些已知药物加以结构改造或人工合成创造出的自然界所没有的新药物 由于约定俗成 生化药物不包括抗生素 抗生素早已自成体系 也不包括用微生物 细菌 病毒 主克次体 微生物和动物毒素 人和动物的血液及组织等制成的供预防 治疗和诊断特定传染病或其它有关疾病的生物制品 习惯上也不包括中药制成的中药制剂 生物化学制药主要采用化学提取法 3 中国的三大药源 化学药物 生物药物 中草药 生化药品 生物制品 现代生物技术药物 中国药典2005年分为1部 2部和3部药典1部收载药材及饮片 植物油脂和提取物 成方制剂和单方制剂等 药典2部收载化学药品 抗生素 生化药品 放射性药品及药物辅料等 药典3部收载生物制品 首次将 生物制品规程 并入药典 生化药物的分类 一 按药物的化学本质来分类 二 按药物的来源来分类 一 按药物的化学本质来分类 1 氨基酸及其衍生物类药物2 多肽和蛋白质类药物 蛋白质类药物有白蛋白 丙种球蛋白 胰岛素 多肽类有催产素 降钙素 胰高血糖素 3 酶与辅酶类药物 消化酶 氧化还原酶 抗肿瘤酶 4 核酸及其衍生物类药物 DNA RNA 单核苷酸 碱基 5 糖类药物 以粘多糖为主6 脂类药物 脂肪酸类 磷脂类 胆酸类 固醇类 卟啉类 国内主要的生化药品种类和厂家一览表 二 按药物的来源来分类 1 人体来源的生物药物 人血液制品 胎盘制品 尿制品 2 动物来源的生物药物 蛇毒 蜂毒 3 植物来源的生物药物 是中草药的主要成份 4 微生物来源的生物药物 氨基酸 维生素 酶 5 海洋生物来源的生物药物 种类繁多 成份复杂 人体来源的药物 人体来源药物的特点人体来源药物的种类人体来源药物的前景和问题 人体来源药物的特点 1 安全性好 药物与人体具有同源性 不会发生排斥反应2 效价高 疗效可靠 纯化的血浆因子制剂 要比原血浆高出10 1000倍 3 稳定性好 提纯产品均可制成冻干制剂 有利于贮存 运输 使用 人体来源药物的种类 人血液制品人细胞因子人体来源的其它原料物质人体激素 血液成份制品又可为 1 红细胞 RBC 2 白细胞 WBC 3 血小板 4 血浆在使有输入全血的治疗措施中 有50 以上的患者只要输入红细胞就已经足够了 另30 则只须输入血液中的其它成份就能达到满意的疗效 因此 利用血液的单一成份进行治疗 已经成为目前的一个趋势 分离血液成份的技术有 离心法 过滤法 人血液制品 全血制品血细胞制品血浆制品 红细胞制剂 用红细胞代替全血 在国内已经逐渐推广应用 是心脏病 慢性肾病 肝病患者补充血红蛋白的首选品种 全血和红细胞保存于4 2 内可保存35天冰冻贮藏红细胞 是长期保存红细胞的有效方法 是指地 80 到 196 之间的低温进行保存 其优点是可以贮备多年 重融之后性能很好 缺点是贮藏费用太高 白细胞浓缩液 白细胞是生产干扰素 INFa 的重要原料 所采集到的人体白细胞具有组织相容的HLA位点 不同人体之间的白细胞存在着抗原 抗体凝聚反应 和细胞毒性作用 这是制约白细胞制剂应用的原因之一 另外 目前白细胞的体外保存技术尚未解决 这是制约白细胞制剂应用的原因之二 100 000 300 000 mm3 4 6million mm3 嗜碱性粒细胞Eosinophil 血小板制剂 血小板制剂的分离和使用在国外已经比较普遍 而在国内尚未推广应用 血小板制剂的适应症为白血病 淋巴瘤 再生障碍性贫血等等疾病 血小板保存于特制的袋内 在22 2 内并不断振荡 可保存5天血小板制剂输入人体之后 常常很快会产生抗体 从而使输入的血小板制剂遭到破坏 因此 最好输入那种HLA相容的血小板制剂 新鲜冰冻血浆 FFP 新鲜冰冻血浆是指刚采集到的新鲜血液 在 30 的温度下 保存时间不超过1年的血浆 新鲜冰冻血浆能够有效地保存血浆中各种生物活性成份的功能 可在许多临床疾病的治疗中使用 组成人体血浆的成份 血浆占人体体重的量 8 血浆占全血的量 50 血浆中的水分占血浆的量 92 血浆中的蛋白质占血浆的量 6 7 白蛋白 Alb 免疫球蛋白 IgG 65 免疫球蛋白 IgG IgM 纤维蛋白原 Fg 补体 C3 转铁蛋白 Tr 巨球蛋白 a2M 触珠蛋白 Hp a1抗胰蛋白酶 a1AT 血色素结合蛋白 Hpx a1 酸性糖蛋白G a1AG 25 其它百作种微量蛋白质和多肽成份 10 血浆成分制品 转输蛋白类免疫球蛋白凝血系统蛋白补体系统蛋白蛋白酶抑制物类 转输蛋白类 转输蛋白是指能够对机体的营养物质 代谢产物 激素 药物进行转输的血浆蛋白 具体有 1 白蛋白 转输脂肪酸 色素 阳离子 药物 VC 2 前白蛋白 转输甲状腺素结合蛋白 视黄醇结合蛋白 3 类脂蛋白 转输脂质 胆固醇 激素 4 类脂蛋白 转输脂质 胆固醇 激素 5 触珠蛋白 转输游离血红蛋白 6 血红蛋白结合蛋白 转输游离血红蛋白 7 转铁蛋白 将铁转输给网织红细胞和其它组织 8 铜蓝蛋白 转输铜 调节铜吸收形成酶 9 转钴胺蛋白 转输VB12 10 GC球蛋白 转输维生素B族 免疫球蛋白 免疫球蛋白构成机体防御感染的体液免疫系统 免疫球蛋白种类 IgG IgA IgM IgD IgE 凝血系统蛋白 凝血系统蛋白维持机体的正常凝血机制 分为 1 凝血因子 凝血系统共有13种凝血因子 2 抗凝血因子 抗凝血因子有纤溶酶原 Pg 当它被尿激酶激活之后 就具有溶解血栓的作用 内源性凝血 外源性凝血 接触异面 组织损伤 a a a Ca2 血小板磷脂 a Ca2 血小板磷脂 凝血酶原激活物 a Ca2 血小板磷脂 凝血酶原 凝血酶 a 纤维蛋白原 纤维蛋白单体 纤维蛋白多聚体 a Ca2 接触因子 Ca2 血小板磷脂 凝血酶原激活物 Ca2 在凝血过程中的作用血小板磷脂的作用血凝过程的正反馈纤维蛋白对血小板的聚集凝血酶对血小板聚集的促进作用凝血酶对自身形成的促进作用 13种凝血因子 因子1 纤维蛋白原 Fg 因子2 凝血酶原 FII 因子3 组织因子 FIII 因子4 钙离子因子5 前加速素 易变因子 FV 因子6 因子7 前转化素 稳定因子 FVII 因子8 抗血友病因子 AHF 因子9 血浆凝血激酶成份 PTC 因子10 Stuart因子 FX 因子11 血浆凝血激酶前质因子12 接触因子 FXII 因子13 纤维蛋白稳定因子 FSF 激肽酶原 pK 高分子量激肽酶原 HMW 纤溶酶原 Pg 蛋白C PC 纤溶酶原 纤溶酶 血管内皮纤维溶酶原激活物 组织纤维溶酶原激活物 血浆纤维溶酶原激活物 血浆纤维溶酶原激活物原 a 纤维蛋白 降解物 血浆中的抗纤溶酶 补体系统蛋白 补体系统是机体的主要防御系统之一 1 补体系统在细胞吞噬 调理 趋化性 细胞凋亡过程中起重要作用 2 补体系统在自身性免疫疾病中 起着损伤机体的作用 补体的作用方式分为三种途径 1 补体传统活化途径 9种补体成份 C1q C1r C1s C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 其中C1q C1r C1s为识别单位 C2 C3 C4为活性单位 C5 C6 C7 C8 C9为膜攻击单位 2 补体旁路活化途径 B因子 D因子 P因子 3 补体旁路活化过程中的调节因子 C36 INA IH 蛋白酶抑制物类 a1 抗胰蛋白酶 a1 AT 能够保护机体的正常细胞不受蛋白酶的破坏和损伤 能协助控制感染和炎症 a1抗糜蛋白酶 a1X 能够保护机体的正常细胞不受蛋白酶的破坏和损伤 维持机体内环境恒定 a间胰酶抑制剂 IaI 具有制约 中和 清除某些蛋白酶的作用 能防止凝血系统蛋白酶的自身消化 抗凝血酶III ATIII 在肝素的促进下 与凝血酶形成复合物 使得凝血酶失活 防止血栓形成 Ci脂酶抑制剂 Ci INH a2巨球蛋白 a2M 具有制约 中和 清除某些蛋白酶的作用 能防止凝血系统蛋白酶的自身消化 a2抗纤溶酶 a2AP 人细胞因子 1 骨骼生长因子 BGF 来源于人骨 2 骨形成蛋白 BMP 来源于人骨 3 干扰素 IFN IFN 来源于白细胞 调节免疫活性IFN 来源于成纤维细胞 调节免疫活性IFN 来源于淋巴细胞 调节免疫活性 4 血小板衍化生长因子 PDGF 来源于血小板 5 结缔组织活性肽 III CATP III 来源于血小板 6 白细胞介素 1 IL 1 来源于人血 巨噬细胞 7 白细胞介素 2 IL 2 来源于人T淋巴细胞 8 B细胞生长因子 BCGF 来源于人末梢血管淋巴细胞 9 骨肉瘤衍化生长因子 ODGF 来源于人骨肉瘤细胞株 10 红细胞生长因子 EPO 来源于胎儿肾 11 集落刺激因子 CSF 来源于人组织 血 尿 12 促生长因子 生长调节素 SM 来源于人血浆 13 巨噬细胞集落刺激因子 M CSF 来源于人巨噬细胞人细胞因子由于数量十分稀少 目前已经被基因工程产品所代替 如干扰素a 白细胞介素 2 IL 2 的生产 人体来源的其它原料物质 1 人胎盘2 人尿 人胎盘 从人的胎盘中提取的蛋白主要有 1 人胎盘丙种球蛋白 2 人胎盘白蛋白 3 人胎盘RNA抑制剂 从人的胎盘中提取的激素有 1 绒毛膜促性腺激素 HCG 2 绒毛膜促乳激素 HCS 人尿 从健康的男性人尿可以制备 1 尿激酶 2 激肽释放酶 3 尿抑胃素 4 蛋白酶抑制剂 5 睡眠因子 6 集落刺激因子 CSF 7 表皮生长因子 EGF 从妊娠妇女和绝经期妇女尿液中可以提取 1 绒毛膜促性腺激素 HCG 人体激素 人体激素主要有 1 蛋白质类激素 2 多肽类激素 3 氨基酸衍生物类激素 4 脂类激素人体激素很少是大分子蛋白质 因此很少出现免疫反应 1 血液的进一步开发血浆蛋白质总共可以分为五个组分 目前仅仅利用了其中的第1组分 纤维蛋白原 第2组分 免疫球蛋白 第5组分 白蛋白 而对于第3组分和第4组分中所含有的大量血浆蛋白成份 基本上没有加以利用 其原因是由于这些物质含量较低 提纯难度较大 第3组分中含有IgA IgM 凝血因子II VII IX X 蛋白C 纤溶酶原 2 巨球蛋白 微球蛋白 补体成份C3 C4 C5 C8 球蛋白 球蛋白 第4组分中含有抗凝血酶III 1抗胰蛋白酶 铜蓝蛋白 转铁蛋白 触珠蛋白 补体Ci脂酶抑制物 前白蛋白 人体来源药物的前景和问题 2 其它原料的进一步开发 对于胎盘 尿液的提取技术也在不断发展之中 3 现代生物技术的进一步应用 基因工程 蛋白质工程 细胞工程 酶工程在血液制品的生产中有了较大的发展和应用 4 人体组织器管制药的法律问题和伦理问题 国际上禁止利用人的器官和组织来生产药物 动物来源的药物 利用动物的组织器官生产药物 在我国于1950年代开始生产 当时被称为 脏器制药 1980年之后被称为 生化药物 目前我国国内已经能够生产200多种来源于动物机体的生化药物动物来源药物的种类和用途动物来源药物的前景和问题 动物来源药物的种类和用途 1 动物多肽类药物2 动物蛋白质类药物3 动物酶与辅酶类药物4 动物核苷酸类药物5 动物糖类药物6 动物脂类药物7 动物细胞因子 乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊 1 动物多肽类药物 1 多肽激素 2 多肽类细胞因子 1 多肽激素 下丘脑激素 促甲状腺激素释放激素 TRH 生长激素抑制激素 GRIF 促性腺激素释放激素 LHRH 垂体多肽激素 促肾上腺皮质激素 ACTH 促黑激素 MSH 脂肪水解激素 LPH 催产素 OT 加压素 AVP 甲状腺所分泌的激素 甲状腺素 T4 甲状旁腺素 PTH 降钙素 CT 胰腺所分泌的激素 胰岛素 胰高血糖素 胰解痉多肽 胃肠道激素 胃泌素 胆囊收缩 促胰酶素 CCK PZ 肠泌素 肠血管活性肽 VIP 抑胃肽 GIP 缓激肽 P物质 胸腺所分泌的激素 胸腺素 胸腺肽 胸腺血清因子 2 多肽类细胞因子 脑氨肽蛇毒胎盘提取物脾水解物肝水解物心脏激素转移因子抗癌肽 2 动物蛋白质类药物 1 蛋白质类激素 生长素 GH 催乳激素 PRL 促甲状腺素 TSH 促黄体生成素 LH 促卵泡激素 FSH 人绒毛膜促性腺激素 HCG 绝经尿促性腺激素 HMG 血清性促性腺激素 SGH 胰岛素 胰抗脂肝素 松驰素 尿抑胃素 2 血浆蛋白质 动物血浆蛋白质与人体的血浆蛋白质有差异 动物血浆蛋白质制品不能直接应用于人体 3 蛋白质类细胞因子 4 粘蛋白 胃膜素 硫酸糖肽 内在因子 血型物质A 血型物质B 5 胶原蛋白 明胶 阿胶 氧化聚合明胶 6 其它蛋白 硫酸鱼精蛋白 胰蛋白酶抑制剂 3 动物酶与辅酶类药物 1 促消化酶类 胰酶 淀粉酶 脂肪酶 蛋白酶 纤维素酶 木瓜蛋白酶 黑曲霉的酶 胃蛋白酶 2 消炎酶类 蛋白酶 溶菌酶 菠萝蛋白酶 a 胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 明胶肽酶 酶RNA酶 3 治疗心血管疾病的相关酶 纤溶酶 尿激酶 蚓激酶 链激酶 凝血酶 激肽释放酶 弹性蛋白酶 4 抗肿瘤的酶 L 门冬氨酸酶 谷氨酰胺酶 蛋氨酸酶 组氨酸酶 酪氨酸氧化酶 5 与生物氧化过程电子传递有关的治疗酶 细胞色素C 超氧化物歧化酶 SOD 过氧化物酶 6 其它药用酶 有机磷解毒酶 青霉素酶 透明质酸酶 7 动物辅酶类药物 辅酶Q10 辅酶A 4 动物核苷酸类药物 1 核糖核酸 RNA 用于治疗精神迟缓 记忆衰退 动脉硬化性疾呆 静注治疗慢性肝炎 肝硬化 初期肝癌 2 脱氧核糖核酸 DNA 具有抗放射性作用 能够改善机体虚弱疲劳 3 免疫核糖核酸 iRNA 可用于治疗乙肝 肺癌 4 转移因子 TF 治疗恶性肿瘤 5 聚肌胞苷酸 聚肌胞 poly C 是干扰素的诱导物 具有广谱抗病毒作用 6 核酸 氨基酸混合物 用于气管炎 神经衰弱 7 辅酶A CoA 用于动脉硬化 白细胞减少 血小板减少 肝病 肾病 8 脱氧核苷酸钠 用于放疗化疗引起的急性白细胞减少症 9 一磷酸腺苷 AMP 对外周血管具有扩张作用 治疗静脉曲张性溃疡 10 三磷酸鸟苷 GTP 用于慢性肝炎 进行性肌肉萎缩 11 辅酶I NAD 用于白细胞减少 冠状动脉硬化 12 辅酶II NADP 促进体内物质生物氧化 5 动物糖类药物 动物糖类药物以粘多糖为主 1 粘多糖的种类 2 粘多糖的药用价值 3 粘多糖的制备方法 1 粘多糖的种类 广义的粘多糖包括 1 粘多糖 2 粘蛋白 3 糖蛋白 4 糖脂 粘多糖主要分布于动物的骨 软骨 皮 角 血管 肠 滑膜液 脑 角膜 肺 肝 心 尿等等原料之中 2 粘多糖的药用价值 甲壳质 几丁质 用作人造皮肤 人造血管 手术线 具有消炎 止酸作用 硫酸软骨素 CS 治疗关节炎 神经痛 腰痛 眼病 具有抗血栓作用 用于治疗多种心脏疾病 肝素 抗凝血药物 治疗血栓疾病 透明质酸 HA 用于眼科手术 烧伤 化妆品 3 粘多糖的制备方法 1 原料处理 2 提取 3 去除非粘多糖 4 脱色 5 脱蛋白 6 纯化 7 乙醇分级沉淀 8 季铵盐络合沉淀 9 离子交换柱层析分离 10 分子筛分离 11 亲和层析 6 动物脂类药物 动物脂类药物主要包括 1 脂肪酸及其衍生物 2 磷脂类 3 胆酸类 4 固醇类 5 卟啉及其衍生物类 动物脂类药物主要分布在脂肪组织 肝脏 磷脂类物质主要分布在脑 脊髓之中 1 动物脂类药物的种类和分布 2 动物脂类药物的制备方法 1 动物脂类药物的种类和分布 脑磷脂 分布在脑 酵母之中 用于止血 防止动脉硬化以及神经衰弱 磷脂酰胆碱 卵磷脂 分布于脑 大豆 卵黄之中 防止动脉硬化以及神经衰弱 肝病 花生四烯酸 分布于动物的肾上腺 降血脂 用于合成前列腺素E2 鱼肝油脂肪酸钠 分布在鱼肝油中 止血 治疗静脉曲张 前列腺素E1 E2 分布于羊精囊之中 降血压 中期引产 催产 原卟啉 分布于动物血红蛋白之中 治疗急 慢性肝炎 血卟啉衍生物 肿瘤放疗辅助剂 胆红素 从胆汁中来 消炎 抗氧化胆酸钠 从胆汁中来 治疗胆酸缺乏症 胆酸 从胆汁中来 合成人工牛黄的原料 猪去氧胆酸 从胆汁中 降胆固醇 治疗气管炎 人工牛黄 配制 消炎 解毒 胆固醇 于脑 脊髓 合成人工牛黄的原料 辅酶Q10 分布心肌 治疗高血压 急性肝坏死 2 动物脂类药物的制备方法 提取法 索氏提取法 可用于提取脑磷脂 磷脂酰胆碱 卵磷脂 脂肪酸 水解法 通过水解血红素 可以制得原卟啉 生物转化法 花生四烯酸通过生物转化 可变成前列腺素E1 E2 化学合成和半合成法 不常用 7 动物细胞因子 1 骨髓生长因子 BGF 2 骨髓衍化生长因子 BDGF 3 软骨衍化生长因子 CDGF 4 软骨衍化因子 CDF 5 骨形成蛋白 BMP 6 细胞分裂因子 CDF 7 内皮细胞衍化生长因子 ECDGF 8 内皮细胞生长因子 ECGF 9 表皮生长因子 EGF 10 成纤维细胞生长因子 FGF 11 酸性成纤维细胞生长因子 AFGF 12 脑成纤维细胞生长因子 BFGF 13 胰岛素样生长因子 IGF 14 神经生长因子 NGF 15 多功能集落刺激因子 Multi CSF 16 乳腺刺激因子 MSF 17 睾丸衍化生长因子 动物来源药物的前景和所要注意的问题 1 发展前景2 问题 1 发展前景 1 动物来源药物的原料十分丰富 可以从中制备出人体所需要的各种生物活性物质 2 动物来源药物的活性成份的深入研究 尤其是动物毒素的研究 3 利用生物技术 化学技术进行合成和半合成 4 现代生物技术在动物来源药物制造上的应用 2 所应该注意的问题 组织相容性问题 是动物来源药物的核心难题 动物来源药物的蛋白质注射到人体内 会产生抗原反应 严重者会危及生命 植物来源的药物 植物来源的药物的种类和用途植物来源的药物的研究前景 植物来源的药物的种类和用途 植物来源的药物是我国中草药的主要来源 经过详细记载的就有5000种 分类1 根据药用价值来分类2 根据化学结构来分类种类1 植物蛋白质 多肽 酶类以及药理作用2 植物糖类生物活性物质以及药理作用3 植物脂类生物活性物质以及药理作用 1 根据药用价值来分 1 抗肿瘤药物 喜树碱 秋水仙碱 硫酸长春碱 硫酸长春新碱 靛玉红 2 强心药 铃兰毒苷 去乙酰毛花洋地黄苷 洋地黄毒苷 地高辛 3 抗菌消炎药 鱼腥草素 秦皮乙素 黄苓苷 穿心莲内脂 盐酸小檗碱 4 抗凝血药 双豆香素 5 镇痛药 盐酸吗啡 颅痛定 延胡索已素 桉油 6 作用于神经系统的药物 咖啡因 盐酸可卡因 刺乌头碱 天麻素 7 搞疟药物 盐酯奎宁 青蒿素 8 止咳平喘药物 磷酸可待因 茶碱 艾叶油 牡荆油 芸香草油 满山红油 2 根据化学结构来分 1 糖和糖苷类 2 苯丙素类 苯丙烯 苯丙酸 香豆素 3 醌类 辅酶Q10 紫草素 4 黄酮类 黄酮醇 花色素 黄苓苷 5 鞣质 奎宁酸 槲皮素 6 萜类物质 青蒿素 齐墩果酸 7 甾体类物质 乌沙苷原 毛地黄毒苷 8 生物碱 咖啡因 喜树碱 1 植物蛋白质 多肽 酶类以及药理作用 1 天花粉蛋白 用于引产 能够水解糖苷键 2 蓖麻毒蛋白 抗癌 3 植物凝集素 PHA 凝集红细胞 白细胞 4 胰蛋白酶抑制剂 抑制胰蛋白酶 治疗胰腺炎 烧伤 5 相思豆毒蛋白 抗癌 6 苦瓜胰蛋白 降血糖 7 菠萝蛋白酶 消炎 水解蛋白质 促消化 8 木瓜蛋白酶 促消化 消炎 9 无花果蛋白酶 驱虫剂 10 木瓜凝乳蛋白酶 促消肿 消炎 11 辣根过氧化物酶 HRP 诊断试剂 12 麦芽淀粉酶 助消化 13 脲酶 分解尿素 14 植物SOD酶 抗氧化 15 辣根过氧化物酶的提取 2 植物糖类生物活性物质以及药理作用 1 单糖类 葡萄糖 果糖 核糖 脱氧核糖 木糖 2 单糖酸类 维生素C 3 单糖醇类 木糖醇 山梨醇 肌醇 甘露醇 4 低聚糖类 蔗糖 麦芽糖 棉籽糖 5 多聚糖类 淀粉 纤维素 人参多糖 黄芪多糖 海藻酸 6 糖的衍生物类 葡萄糖 6 磷酸 果糖 1 6 二磷酸 磷酸肌醇 氨基葡萄糖 植物糖类药用成份举例 植酸钙 是营养剂 具有促进生长发育的作用 肌醇 治疗肝硬化 血管硬化 降血脂 葡萄糖 大输液 补充营养 葡萄糖醛酸内酯 治疗肝炎 肝中毒 风湿性关节炎 葡萄糖酸钙 补钙剂 甘露醇 抗脑水肿 降颅压 山梨醇 抗脑水肿 降颅压 海藻酸 增加血容量 抗休克 人参多糖 增强免疫机能 5 植物脂类生物活性物质以及药理作用 天然药物化学中的 1 醌类 2 黄酮类 3 萜类 4 甾体类 5 苯丙酸类 6 鞣质 等等均属于植物脂类药物 1 脂肪和脂肪酸类 亚油酸 亚麻酸 花生四烯酸等不饱和脂肪酸 2 磷脂类 大豆磷脂 含卵磷脂 3 固醇类 谷甾醇 大豆固醇 4 黄酮类 茶叶中提取茶多酚 植物来源的药物的研究前景 1 植物细胞培养技术由于植物细胞体型大 接种量大 培养周期长 易污染杂菌等等缺陷 目前仍存在着较大的困难 尤其是没有理想的培养设备和装置 2 植物组织培养技术通过组织培养生产植物药有效成份 有利于解决生药资源断缺的难题 如从红豆杉中提取紫杉醇 已经给红豆杉这一珍稀树种带来了灭顶之灾 3 天然植物来源药物分离纯化 功能结构测定 微生物来源的药物 1 细菌 抗生素 氨基酸 维生素 酶制剂2 真菌类 1 冬虫夏草 2 灵芝多糖 3 藻类多糖 4 香菇多糖 海洋生物技术 海洋生物技术是指以海洋生物为对象 综合应用基因工程 细胞操作技术和细胞培养技术等手段 提取海洋生物中的天然药物由于海洋药物中的天然活性成份含量低 分离提纯的生产成本较高 因此 人们研究了海洋微生物的培养和发酵技术 以期提高产量 近10年中 已经有5000种新的海洋天然药物被发现 海洋生物来源的药物 海洋生物药物的种类和用途海洋生物药物的研究前景 海洋生物药物的种类和用途 1 海藻类 分为绿藻门 褐藻门 蓝藻门 红藻门等10个门类 目前已经生产出褐藻酸钠 烟酸甘露醇脂 用于抗肿瘤和治疗心血管疾病 2 腔肠动物类 从柳珊瑚中提取出前裂腺素A2 萜类药物用于抗菌 从海葵中已经分离出具有抗癌作用的Polytoxin 3 软体动物类 软体动物有8万种 如螺类 蛤类 乌贼 从软体动物中分离出的物质有多糖 多肽 毒素 酶 凝聚素等等物质 具有抗病毒 抗菌 抗肿瘤 降血压 止血 平喘等作用 4 节肢动物类 从虾 蟹壳中提取出甲壳素 可以用作丸片赋形剂 缓释药物载体 医用膜材料 此外 甲壳素还具有抗血栓的功能 5 棘皮动物类 有6000多种 包括海星 海胆 海参等 海胆的毒至少具有溶血作用 海胆中还含有二十碳五烯酸 EPA 用于防治冠心病 海参素具有抗癌作用 6 鱼类 有20000多种 用于制造药物的有 鱼肝油 鱼软骨素 鱼细胞色素C 卵磷脂 脑磷脂 鱼类中的抗癌药物有 1 鲨鱼抗问号蛋白 2 河豚鱼肝油等 7 海洋爬行动物类 主要有蛇毒 蛇毒中含有蛋白酶 透明质酸酶 转氨酶 胆碱脂酶 RNA酶 DNA酶 磷脂酰胆碱酶等等 具有镇痛作用 8 海洋哺乳动物类 海洋哺乳动物的脏器和腺体已经制成了多种药物 如鲸鱼肝脏抗贫血剂 海狗骨骼肌17肽具有扩张血管 降低血压等作用 9 其它海洋动物 有海绵动物 环节动物 两栖动物等等 具有药用价值的海洋药物 1 鲨鱼抗癌蛋白 抗Lewis肺癌 2 棘皮动物抗癌肽 抗白血病 3 软体动物抗癌肽 蛤素 抑制非病毒性肿瘤 4 海扇抗癌糖蛋白 抑制肉瘤P180结节性肿瘤 5 海兔卵抗癌肽 抑制P180淋巴白血病细胞 6 沙群海葵素 抑制P388淋巴白血病细胞和K细胞 B细胞生长 7 降钙素 降低血钙 血磷 抑制骨钙流失 8 海蛇毒素 镇痛 9 海葵毒素 强心作用 10 海绵抗生肽 抗真菌 抗细菌 11 软体动物抗生肽 抗病毒 抗细菌 12 抗炎肽 风湿性关节炎 13 硫酸软骨素 降血脂 抗动脉硬化 抗凝血 治疗冠心病 14 刺参酸性粘多糖 广谱抗肿瘤 抗凝血 15 甲壳质 药用赋形剂 16 海参苷 抗肿瘤 抗真菌 抗辐射 17 海星皂苷 抗肿瘤 抗真菌 抗辐射 18 海绵毒素 溶血活性 19 肽类药物 具有免疫 抗肿瘤 抗病毒作用 20 鲍鱼多糖 具有抗肿瘤生长作用 21 紫菜多糖 具有抗肿瘤 防止心血管疾病的作用 22 芋螺毒素 是理想的不会成瘾的麻醉镇痛剂 23 由海绵中分离出的多环胍生物碱 具有抗病毒 抗癌 抗真菌作用 24 膜海鞘素 具有抗病毒 抗癌 免疫抑制作用 25 从红海海绵中分离的AvaroneAvarol 对艾滋病病毒有抑制作用 26 从海洋细菌中分离出的大环内酯化合物 具有抗病毒 抗癌 抗菌作用 海洋生物药物的研究前景 1 目前已经取得进展的相关领域2 海洋药物研究的主攻方向 1 目前已经取得进展的相关领域 1 具有抗癌活性的海洋药物 目前进入临床的有 从群体海葵中取处的didemnin 从截尾海兔中提取的dolastatin10 从多室草苔虫中提取的bryostatin1 bryostatin4 从海洋细菌中提取的marinactan 从海绵中提取的manoalide 2 具有抗菌活性的海洋药物 日本从海洋细菌中提取出广谱抗菌素 伊他霉素 3 具有抗心血管疾病活性的海洋药物 从海洋药物中提取的喹啉酮类具有增强心肌收缩力 抗心率失常的作用 4 具有抗放射性活性的海洋药物 日本已经从海洋藻类中提取出SOD 5 海洋前列腺素 从珊瑚中提取前列腺素 6 从海洋生物中提取的保健品 这类产品有螺旋藻 蓝藻 二十碳五烯酸 EPA 二十二碳六烯酸 DHA 7 从海洋生物中提取的医用生物材料 鲎试剂 河豚毒素试剂 甲壳素 珊瑚骨科材料 2 海洋药物研究的主攻方向 1 海洋生物活性物质的研究 2 促进生物技术在海洋药物研究上的应用 3 开发海洋中成药制剂和新的剂型 4 开发海洋生物 生产营养保健品 5 从海洋生物中开发新的医用生物材料 如利用甲壳质生产创可贴 手术缝合线 利用海洋生物多糖类产品生产胶囊辅料 利用海洋藻类生产SOD 二 生化药物的制备技术 一 原料的选择 预处理 保存 二 提取 三 分离纯化 一 原料的选择 预处理 保存 1 原料选择2 原料预处理3 原料保存 1 原料选择 1 有效成份含量高 2 原料丰富易得 3 杂质含量少 4 原料成本低 植物原料应注意采收的时期 以免有效成份积累不足 动物原料要注意动物的年龄和性别 微生物原料应注意其对数生长期 2 原料预处理 动物原料采集后应立即去除结缔组织 脂肪组织 并就地冷冻 植物原料采集后就地除去不用的部分 微生物材料采集后应将细菌细胞和培养液分开 并进行保鲜处理 3 原料保存方法 1 冷冻法 常用 40 进行速冻 2 有机溶剂脱水法 常用的有机溶剂是丙酮 因为它对于没有破坏作用 如用它来保存脑垂体 3 防腐剂保鲜 如用乙醇 苯酚 该方法适用于液体原料 如发酵液 提取液 二 生物药物的提取 1 生物组织破碎2 有效成份的提取 1 生物组织破碎 1 磨切法 组织捣碎机 胶体磨 匀浆器 匀质机 球磨机 乳钵 2 压力法 加压破碎 减压破碎 3 反复冻融法 4 超声波震荡破碎法 5 自溶法 6 酶解法 2 有效成份的提取 1 提取试剂 水 缓冲溶液 盐溶液 乙醇 氯仿 丙酮 2 提取方法 盐析 萃取 渗透 过滤 三 生物药物的分离纯化方法 1 蛋白质药物2 核酸类药物3 糖类药物4 脂类药物5 氨基酸药物 1 蛋白质药物的分离纯化方法 1 沉淀法 2 按分子大小分离 3 按分子所带电荷进行分离 4 层析法分离 1 沉淀法 盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法与靶物质特异性结合沉淀法 2 按分子大小分离 超滤法透析法凝胶层析法超速离心法 3 按分子所带电荷进行分离 离子交换术层析法电泳法等电点聚焦法 4 层析法 亲和层析法 与靶物质特异性结合 再进行层析的方法 疏水层析法 用于分离非极性药物 2 核酸类药物的分离纯化方法 1 提取法生产方法 先得取核酸与蛋白质的复合物 再解离核酸与蛋白质 然后分离RNA与DNA 3 糖类药物的分离纯化方法 1 提取方法 2 分离方法 1 提取方法 非降解法 主要用于提取动物组织中的粘多糖 提取所采用的溶剂是水 盐溶液 降解法 主要用于提取结合牢固的粘多糖 如从软骨中提取硫酸软骨素就是采用碱降解法 提取与蛋白质结合的多糖则常常采用酶解法 2 分离方法 沉淀法 乙醇沉淀是最常用的方法 4 5倍量的乙醇能使任何组织中的粘多糖完全沉淀 离子交换层析法 采用阴离子交换剂 如Dowex I X2离子交换树脂 DEAE 离子交换纤维素等 洗脱液用氯化钠溶液进行梯度洗脱 4 脂类药物的分离纯化方法 提取方法 常用的溶剂有氯仿 甲醇 纯化方法 1 沉淀法 利用脂质在丙酮中溶解度不同而将其沉淀 2 吸附层析法 常用的吸附剂有硅胶 氧化铝 洗脱常常采用逐渐增大极性的洗脱液来进行洗脱 非极性的脂肪先流出 极性的脂肪后流出 3 离子交换层析法 如TEAE 纤维素对于分离脂肪酸和胆汁酸特别有效 5 氨基酸药物的分离纯化方法 1 氨基酸的生产方法 2 氨基酸的分离方法 1 氨基酸的生产方法 蛋白质水解法 有酸水解 碱水解 酶水解三种方法 其中以盐酸水解最为常用 盐酸水解的优点是水解迅速 完全 产物全部是L 型氨基酸 盐酸水解的缺点是色氨酸全部被破坏 丝氨酸部份被破坏 碱水解易产生消旋作用 故较少使用 酶水解常常不够完全彻底 2 氨基酸的分离方法 沉淀法 依据不同氨基酸的溶解度差异进行沉淀分离 吸附法 利用活性炭对其进行吸附 离子交换法 常用离子交换剂为强酸性阳离子交换树脂 洗脱方法主要采用PH梯度洗脱 生物化学制药实例 一 人体来源的生物药物二 动物来源的生物药物三 植物来源的生物药物四 海洋生物来源的生物药物 一 人体来源药物的制备实例 一 人血白蛋白 Alb 制剂的制备 二 尿激酶 URK 的制备 三 绒毛膜促性腺激素 HCG 的制备 四 白细胞介素 2 IL 2 的制备 一 人血白蛋白 Alb 制剂的制备 白蛋白又称清蛋白 约占血浆总蛋白的65 同种白蛋白制品无抗原性 白蛋白为单链分子 由548个氨基酸组成 白蛋白的制备方法有二种 1 从健康人体的血浆中分离制取 2 从健康产妇的胎盘中分离制取白蛋白的制备工艺分为6步 1 络合 2 解离 3 浓缩 4 热处理 5 除菌 6 干燥 1 工艺 人血浆在搅拌下用NaHCO3调节PH 6 8 加入等体积的2 利凡诺溶液 充分搅拌后 静置2 4小时 分离出上清液 络合物沉淀 在络合物沉淀中加入灭菌蒸馏水 用0 5mol L的HCl调节PH值至弱酸性 加入NaCl量为0 15 0 2 充分搅拌 65 恒温加热1小时 离心除去杂蛋白 分离出上清液 上清液进行超滤浓缩 60 恒温热处理10小时 灭活病毒 除菌过滤 白蛋白溶液 进行冷冻干燥 白蛋白产品 2 人血白蛋白产品的检验方法 1 外观为白色疏松物体 2 白蛋白的含量 95 以上 3 水分 1 4 水溶后PH 6 6 7 2 5 硫酸铵残留量 0 01 6 细菌学检验合格 7 热原检测合格 二 尿激酶 URK 的制备 尿激酶有多种分子形式 主要有分子量为31 3KD 54 7KD二种 属丝氨酸蛋白酶 底物 血纤溶酶原 作用其Arg Val键 使纤溶酶原转为纤溶酶 尿激酶用于治疗各种血栓和血栓性梗塞 1 工艺 尿激酶的生产工艺分为10步 1 沉淀 2 酸化 3 吸附 4 洗涤 5 洗脱 6 除去热原和色素 7 浓缩 8 洗脱 9 透析 10 冻干 工艺路线 工艺流程框图 所收集到的男性应该在8小时之间进行处理 收集流出的活性部分 用1mol L的Hac调节PH 4 2 用蒸馏水调节电导率至16 17M 欧姆 装入羧甲基纤维素柱 CM C 用10倍体积的 PH 4 2的Hac NaAc缓冲液洗涤柱床 促进吸附 酸化以后的尿加入1 的硅藻土 在5 下搅拌1小时 在温度10 以下操作 尿液的原始PH 8 5 透析液进行冷冻干燥 得尿激酶产品 上述收集液用饱和的NaH2PO4调节PH 8 0 加入NaCl 调节电导率为22M 欧姆 通过DEAE Sephadex A 50层析柱 除去热原和色素 用0 1 氨水 0 1mol L的NaCl PH 11 5 11 8 的洗脱液进行洗脱 用0 02 氨水 0 1mol L的NaCl的洗脱液进行洗脱 当流出的洗脱液从澄清开始变混浊时 加以收集 将硅藻土的吸附物用5 的冷水洗涤 装入层析柱 用盐酸调节尿液的PH 6 5以下 电导率为20 30M 欧姆 细菌数量在1000个 毫升以下 收集洗脱液中的活性成份 杂质被吸附在层析柱中 在4 的蒸馏水中进行透析 2 尿激酶产品的质量标准 1 外观为白色冻干粉末 2 酶活力 15000IU mg蛋白质 三 绒毛膜促性腺激素 HCG 的制备 绒毛膜促性腺激素是一种糖蛋白 由 两个亚基组成 绒毛膜促性腺激素由胎盘滋养层合体细胞分泌 妇女妊娠45 70天 尿中HCG的含量达30000 50000IU 24小时 绒毛膜促性腺激素主要用于治疗女性不育症 由于黄体功能不全引起的子宫出血 习惯性流产 1 工艺 绒毛膜促性腺激素的生产工艺包括12步 1 粗制 2 提取 3 透析 4 吸附 5 洗涤 6 洗脱 7 干燥 8 精制溶解 9 精制透析 10 精制吸附 11 精制解吸 12 精制干燥 孕妇尿 用HCl调节PH 4 5 加入苯甲酸 乙醇饱和液 孕妇尿 苯甲酸乙醇饱和液 乙醇 1 0 075 5 搅拌1小时 静置2 3小时 上清液1 上清液2合并 在5 以下 用蒸馏水进行透析 取透析内液进行离子交换层析 先将CM Sepharose柱用0 01mol L的醋酸盐缓冲液进行平衡 将样品加到层析柱上 HCG粗品中加入10倍量的4 0 067mol L PH 4 8的醋酸盐缓冲液 搅拌提取4小时 离心 取上清液1 离心后的沉淀物再用10倍量的4 0 067mol L PH 4 8的醋酸盐缓冲液提取 取上清液2 过滤 弃滤液 得沉淀吸附物 搅拌下加入95 乙醇 直到苯甲酸全部溶解为止 即有絮状沉淀物产生 静置过夜 离心 沉淀物用95 的乙醇和丙酮洗涤 干燥 得HCG粗品 先用0 01mol L PH 4 8的醋酸盐缓冲液洗出洗脱峰 1再用0 01mol L PH 5 9的磷酸盐缓冲液冲出洗脱峰 2再用0 2mol L PH 8 5的醋酸盐缓冲液冲出洗脱峰 3 从洗脱峰 3上得到的就是HCG 30 以下冷冻干燥 得HCG精品 HCG精品在10 以下的蒸馏水中溶解 溶解液用0 5mol L PH 6 8的磷酸盐缓冲液进行透析 透析内液进行羟基磷灰石柱层析 步骤 1 安装羟基磷灰石柱层析柱 2 用0 5mol L PH 6 8的磷酸盐缓冲液平衡 3 样品上柱 先用0 5mol L PH 6 8的磷酸盐缓冲液洗脱 得峰 1再用1 0mol L PH 6 8的磷酸盐缓冲液洗脱 得峰 2 从洗脱峰 2上得到的就是HCG纯品 30 以下冷冻干燥 得HCG产品 四 白细胞介素 2 IL 2 的制备 白细胞介素 2是由活化的淋巴细胞所产生的 含有133个氨基酸的糖蛋白 1 工艺 白细胞介素 2的生产工艺分为10步 1 诱生 2 病毒灭活 3 硫酸铵分级 4 硫酸铵沉淀 5 除盐 6 亲和层析 7 洗涤 8 解吸 9 凝胶层析 10 洗脱 工艺流程图示 取上清液 加入饱和硫酸铵溶液至0 35饱和度 4 静置24小时 离心 弃去沉淀 用鸡瘟病毒和丝裂原培养液联合刺激人外周血白细胞 37 CO2培养箱培养 形成诱生白细胞培养液 得到白细胞介素 2 IL 2 组分 透析内液装入Sepharose 4B层析柱 用200ml PH 6 5的平衡柱缓冲液洗去不吸附的蛋白质 用含有0 4mol L的NaCl的 PH 6 5的磷酸钠缓冲液 PBS 洗涤亲和柱 用含有1 0mol L的NaCl的 PH 6 5的磷酸钠缓冲液 PBS 进行解析 将沉淀物溶解于10mol L PH 6 5的磷酸钠缓冲液 PBS 缓冲液含2 g ml 的正丁醇 0 15mol L的NaCl 然后装入透析袋中 用10mol L PH 6 5的磷酸钠缓冲液透析24小时 期间更换5次透析外液 取上清液 补充加入饱和硫酸铵溶液至0 85饱和度4 静置24小时 离心 收集沉淀 进行病毒灭活和固 液分离 1 用6mol L的HCl溶液调节PH 2 0 2 5 2 用6mol L的NaOH溶液调节PH 7 2 7 4 3 离心除去变性沉淀的杂蛋白 对组分进行超滤浓缩 装入到UltrogelACA44层析柱进行凝胶层析 要求PH 7 6 用0 2mol L的Tris HCl 0 5mol L的甘氨酸 0 1 的聚乙二醇 PEG Mr 6000 2 的正丁醇所构成的洗脱剂进行洗脱 得白细胞介素 2 IL 2 纯品 二 动物来源药物的制备实例 一 胰岛素的制备 二 超氧化物歧化酶 SOD 的制备 三 核糖核酸 RNA 的制备 四 透明质酸的制备 五 肝素的制备 六 冠心舒的制备 七 硫酸软骨素的制备 一 胰岛素的制备 胰岛素由二条链组成 A链21个氨基酸 B链30个氨基酸 胰岛素是所有蛋白质中研究得最清楚的一个蛋白 1 工艺 胰岛素的生产工艺分为10步 1 提取 2 碱化 3 酸化 4 浓缩 5 去脂 6 盐析 7 除去酸性蛋白 8 锌沉淀 9 结晶除去碱性蛋白 10 洗涤 11 干燥 工艺流程图示 取上清液进行锌沉淀上清液用氨水调节PH 6 2 6 4加入3 6 的醋酸锌溶液 加入量为溶液量的20 再用氨水调节PH 6 04 下 放置过夜收集沉淀 用冷丙酮洗涤洗涤后的沉淀物进行干燥 得胰岛素粗品 盐析物除酸性蛋白操作盐析物加入7倍量的蒸馏水进行溶解再加入3倍量的冷丙酮 用氨水调节PH 4 2 4 3补加丙酮 使得丙酮 水 3 7搅拌后过夜 离心 除去酸性蛋白质沉淀 浓缩液迅速升温 然后迅速降温 除去脂肪 去脂液用NaCl溶液进行盐析 盐析外液PH控制在PH 2 0 2 5之间 提取液用PH 8 0 8 4的氨水碱化4小时 除去沉淀 碱化液用PH 3 6 3 8的硫酸 在5 时酸化4小时 除去沉淀 酸化液 在30 下进行减压浓缩至比重为1 04 1 06 猪胰脏绞成碎末 加入2 3 2 6倍的86 88 的乙醇 5 的草酸 10 15 之间提取3小时 胰岛素粗品除碱性蛋白质 每克粗品加入2 的柠檬酸溶液50ml 6 5 的醋酸锌溶液2ml 丙酮16ml然后再用冰水稀释至100ml 使样品充分溶解 冷却至5 以下 用氨水调节PH 8 0 过滤 除去碱性蛋白质沉淀 滤液进行结晶操作滤液用10 的柠檬酸溶液调节PH 6 0补加丙酮 使得溶液中的丙酮含量达到16 慢速搅拌3 5小时 使结晶析出再在5 左右放置3 4天 使结晶完全析出 收集结晶 用丙酮 乙醚反复脱水 真空干燥 得结晶胰岛素纯品 二 超氧化物歧化酶 SOD 的制备 超氧化物歧化酶存在于动物 植物 微生物之中 有Gu Zn SOD Mn SOD Fe SOD等等类别 目前 美国 德国 澳大利亚等国都有产品生产 超氧化物歧化酶在抗衰老 抗辐射 消炎方面具有显著的疗效 主要用于炎症 类风湿性关节炎 慢性多发性关节炎 放射治疗之后的炎症 1 工艺 超氧化物歧化酶的生产工艺分为12步 1 收集 2 浮洗 3 溶血 4 去血红蛋白 5 沉淀 6 热处理 7 沉淀 8 透析 9 层析 10 超滤 11 浓缩 12 干燥 工艺流程图示 超滤浓缩 冷冻干燥 得超氧化物歧化酶 SOD 纯品 透析液进行层析操作 1 采用DEAE Sephadex A50层析柱 2 层析柱先用2 5mmol L PH 7 6的磷酸缓冲液进行平衡 3 样品上柱 用缓冲液进行吸附 4 用2 5 5 0mmol L PH 7 6的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱 5 收集SOD的活力洗脱峰 上清液放入透析袋中 在0 的条件下透析6 8小时 沉淀物加入适量的去离子水进行溶解 然后离心 除去水不溶性蛋白 收集上清液 在0 的条件下 澄清液中加入适量丙酮 使其产生大量絮状沉淀 离心除去上清液 收集沉淀物 上清液于55 65 热处理10 15分钟 然后离心 除去热变性蛋白 收集黄绿色澄清液 沉淀物加入适量的去离子水进行溶解 然后离心 除去水不溶性蛋白 收集上清液 在0 的条件下 上清液中加入1 2 1 5倍体积的丙酮 产生絮状沉淀 离心除去上清液 收集沉淀物 加入0 25倍体积的95 乙醇 0 15倍体积的氯仿 搅拌15分钟 离心除去血红蛋白沉淀 收集上清液 洁净的红细胞在5 左右 加入去离子水 搅拌30分钟 进行溶血 新鲜猪血离心去除血浆红细胞用0 9 的NaCl溶液清洗3次 2 超氧化物歧化酶 SOD 电泳鉴定方法 0 5 琼脂糖凝胶平板电泳法 或者采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法 1 缓冲液为PH 8 4的Tris Gly 2 电压梯度22V cm 3 电流3MA cm 4 电泳时间35分钟 5 染色液用0 5 氨基黑10B 6 7 的Hac进行褪色处理 三 核糖核酸 RNA 的制备 采用动物的肝脏生产RNA 具有其它生物来源的RNA所不具备的药物功能 缺点是肝脏组织中成份复杂 因此RNA的提纯难度相当大 1 工艺 用动物的肝脏生产RNA分为10步 1 匀浆制备 2 提取 3 除去杂蛋白 4 沉淀 5 除去糖原 6 精制 7 洗涤 8 溶解 9 分装 10 冻干 在0 的条件下 搅拌加入等体积的0 2mol L的醋酸钠溶液 再加入1 4体积的1 的十六烷基三甲基溴化铵 CTAB 0 的条件下放置30分钟 离心得沉淀物 沉淀物除糖原操作 1 沉淀物溶解在含0 001mol L的EDTA 0 01mol L的醋酸钠溶液中 加入等体积的2 5mol L的K2HPO4 2 不断搅拌下再加入等体积的乙二醇甲醚 3 在0 的条件下 放置30分钟 离心 得上清液 离心清液除蛋白质操作 1 离心清液中加入等量氯仿 反复振荡2 3次 直到中间界面无明显蛋白质层为止 2 向清液中加入1 10体积的20 的醋酸钾 再加入2倍体积的 20 的乙醇 3 在0 的条件下 放置1小时 离心 得白色沉淀物 离心清液进行提取 离心清液中 加入等体积的0 2mol L的三乙醇胺 1 的十二烷基磺酸钠 SDS 0 002mol L的乙二胺四乙酸二钠 EDTA PH 9 0 搅拌均匀 再加入等体积的90 的苯酚 苯酚中含0 2 的8 羟基喹啉 再加入等体积的氯仿 室温振荡30分钟 3500r min离心20分钟 除去沉淀物 健康的猪 牛肝脏用生理盐水洗干净 切成小块 加入1 2倍量的0 1mol L的NaCl 0 05mol L的柠檬酸溶液 再加入0 001 聚乙烯硫酸脂 PVS 和0 1 的 PH 7 0的Triton溶液 用组织捣碎机捣成匀浆 3500r min 然后离心20分钟 除去沉淀物 沉淀物进行反复洗涤操作 1 沉淀物用0 1mol L的醋酸钠溶液 内含0 001mol L的EDTA 洗涤 2 再用70 的乙醇溶液洗涤 3 重复3 5次洗涤 直到没有泡沫 沉淀物进行过滤式除菌操作 沉淀物用 0 001mol L的EDTA 0 14mol L的醋酸钠溶液 溶解 过滤式除菌操作 得无菌RNA溶液 灌装 冻干 得无菌RNA纯品 四 透明质酸 HA 的制备 以雄鸡冠为原料HA的生产工艺