分子生物学实验小技巧.docx

分子生物学实验小技巧主要内容1.SDS-PAGE 2.双向电泳3.质粒提取 4.Western Blot5.溶液配制 6.PCR、酶切、连接并进行凝胶检测7.RNA提取与检测 8.其他SDS-PAGE1.? ? ? SDS-PAGE配制过程中，浓缩胶与分离胶可预先配好大体积（如100ml）预制胶，储存在4度冰箱（注：10% APS，TEMED不加），每次配置时只需吸取所需体积的预制胶加入相应体积APS，TEMED即可，预制胶可储存半年以上，能节省很多时间，更重要的是，可大大减少与丙稀酰胺的接触，减少中毒。2.? ? ? 配胶过程中，普通的SDS-PAGE中加入约13%的甘油，可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。改进过程只需将配方中的水改成60%的甘油即可。3.? ? ? 胶配好后，若过夜使用，待凝聚后不要拔下梳子，把含胶玻璃板从制胶槽取下，注意玻璃板上下两边缘会有气体，所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发，用保鲜膜包上，然后放4度过夜，第二天在电泳槽内直接拔下梳子即可使用。4.? ? ? 分离胶用水压胶不平时，可以换用乙醇（浓度无要求，干净即可），效果较好。5.? ? ? 配置分离胶时因胶凝时收缩常导致加样孔变浅，可以将加剩的胶放入4以降低凝聚速度，而将凝胶放入37度促聚，并随时用4加剩的胶补充下降的胶面；另外将胶横放与水平面成10度角也可以减少收缩的影响。6.? ? ? 丙烯酰胺放置时间过长（超过一年），会吸水潮解，导致胶不凝。7.? ? ? 凝胶时温度高凝胶快，但过高时，会影响交连物的孔径大小，25为宜。8.? ? ? 氧气是胶凝固的终止剂，所以尽量避免胶中气泡出现。9.? ? ? 大肠表达检测时，一般要煮样，但煮出来时常较稠，用8M尿素重悬细胞后再煮效果较好。10.? ?配好的10TBE经过高压灭菌后，不会形成沉淀，可以用很长时间，而且跑出的条带也很漂亮。11.? ?上样时，最后保证上样量一样，包括体积，当体积不同时，可以加缓冲液补全，这样跑出的胶较为一致。所有的加样孔都加样，可以防止边缘的样品拖尾，如样品不多，其余的孔均用上样缓冲液加满，防止影响条带扩散。12.? ?跑胶时，因为低电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形，所以低电压泳道会比高电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。13.? ?跑胶过程中，为节省时间，可以提高电压，但得注意散热，可以冰浴跑胶，将电泳槽放入盛有冰水的盆中，或是冰箱中，节省的时间的同时，效果也较好。14.? ?防止条带跑歪：分离胶配好后4度过夜；在点样的时候紧靠于上样两边的点样孔各上20微上样缓冲液。15.? ?电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，用流水冲玻璃板的缝隙处（也就是凝胶部分），一边冲一边轻轻掀起玻板，用水去充满玻板和胶之间的缝隙，很容易能把玻板掀开。接下来把玻板反过来，让胶面朝下，使其一端浸入到一个盛着水的大平皿中，轻轻晃动，胶很快就会被水带到平皿中了，丝毫不会损伤胶。16.? ?染色时，为节省染色时间，可以先将染色液在微波炉内加热5-10秒，不能太久，避免冰醋酸挥发，然后在水平摇床上放置半个小时即可染色好。如果是旧染色液，隔十分钟加热一次。17.? ?脱色时，可不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉中高火里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次即可。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。18.? ?用硝酸银染色，那么显色时如果迟迟不出现条带，可以再显色夜里加一点甲醛。如果染色或显色没有做好，染成了海带胶，我们可以复染。将胶用一蒸水清洗7.8遍，再重新染色，显色。19.? ?脱色时用0.25M NaCl代替脱色液，效果较好，无毒。20.? ?脱色时，在脱色液中加入娄张捏成条状的擦镜纸或是面巾纸，由于染料吸附到纸纤维上，可以加速脱色，待纸着色较深时，更换新纸条，不用换液。双向电泳1.? ? ? 向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要加满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样可以很好的避免胶条下形成空气泡。2.? ? ? 一向电泳时，盐离子容易聚在胶槽的两侧，剪一小段IPG胶条放在两侧，构成盐桥，电压就容易上去了，避免一向电泳不好影响最后实验结果。3.? ? ? 在做第一相等电聚焦分离的时候，如果空气湿度大，除湿很重要（可通过空调或除湿机），要不等电聚焦仪起的镀金电极会因为冷凝在上面的水汽产生电火花而烧坏。?质粒提取1.? ? ? 质粒提取时，最后一步的酒精挥发对后续酶切等至关重要，尽量延长挥发时间，最好是在空调的热风中挥发。2.? ? ? 加速燥的方法，70%乙醇清洗过后，再加无水乙醇清洗再倒掉无水乙醇，加速挥发。3.? ? ? 利用试剂盒中硅胶柱手提质粒，手提质粒时，配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替试剂盒的solution1、2、3），然后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠（代替结合缓冲液）混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而只要是一样的质粒，试剂盒的硅胶柱可以重复使用，没有试剂盒溶液量的限制。4.? ? ? 质粒提取的最后一步用TE（水）洗硅胶时，一般是加水后放置一分钟，再离心收集DNA。可以加水后当即离心，再次把离心收集的液体重新加到硅胶柱上，放置一分钟，离心，这样得到的质粒的回收率要高出1030%，另外，同一种质粒，用过的柱子可以反复使用（5次）。 。Western Blot1.? ? ? Western Blot在摸索一抗、二抗浓度，封闭时间，曝光时间等条件时，可以一次转膜后，将膜晾干，裁减成小块保存，每次取一小块进行条件摸索，可以避免每次都重新跑胶、转膜甚至是重新提取蛋白，可以节省大量时间。2.? ? ? Western Blot时，转膜后暂存晾干的膜于4条件下比将蛋白保存在Buffer中更可靠。溶液配制1.? ? ? 培养基试剂等配制过程中可先将各成分配成母液，并在常用试剂瓶上写上该试剂配方，方便配制。2.? ? ? 剧毒物质配制过程中，以往是先根据要配的浓度与所需体积算好待称物质的量，其实可以先称好有毒物质，再去调整溶剂的体积，以避免长时间与有毒物质接触。PCR、酶切、连接并进行凝胶检测。1.? ? ? PCR，酶切时，可以将反应液除模板，引物，酶的其他成分配预混合制成Mix形式，储贮在-20冰箱中，用时取出分装，可以避免每次条件不均。2.? ? ? 菌落或菌液直接PCR时，预变性的时间延长至5min，效果较好。3.? ? ? PCR的循环参数的第一步都是94或95度预热35分钟，延伸一般都是72，按照这些参数做PCR一般都可以做出来，但在长片段PCR(2kb)中，由于DNA模板在94高温20秒以上就会发生脱嘌呤反应，当taq酶遇到模板上的这些错误时就会停下来从而使反应不能继续进行，时间越长，模板损坏也越严重，得不到产物的可能性也越大，另外，对于我们实验中用到的许多taq酶来说，72并不是其最佳的反应温度。如Takara LA酶的最适反应温度是68，采用92预热3分钟，95变性15-20秒，退火后于68延伸取得很好的效果，扩过最长的片段为10kb。4.? ? ? 双酶切时，两个酶单独酶切效果要好很多。在第一个酶切完成后，将体系热失活（根据说明书，一般65，20min），再进行第二个酶切。5.? ? ? 提高酶切效率的方法，将要进行酶切的质粒DNA直接放于95的水浴锅中10 s，取出自然放冷，再加样进行酶切。6.? ? ? 高GC含量的酶切位点如NotI，应该用甲基化缺陷的宿主菌如E.coli Top10等。7.? ? ? 用酶切作检测时，在微波炉里面加热1min即可跑胶检测，双酶切可以考虑2min，但酶切不够充分，回收量可能不够。8.? ? ? 琼脂糖凝胶跑完后可以二次点样。9.? ? ? 跑胶过程中，先100V电压跑约15min，再将电压调大至120-130V，进行较小差异电泳，可以避免大片段残存在胶孔不动的情况，跑出来的带较为漂亮且省时。10.? ?做连接时，连接buffer一定要避免反复冻融，可在第一次用时就分装成小份，三次以上冻融会大大降低连接效率。 RNA提取与检测1.? ? ? ?RNA电泳过程中，预电泳5-10min 减少了非特异RNA条带的出现，有利于分离和纯化，同时可根据电泳仪是否冒泡判断电泳仪装置是否有误。2.? ? ? ?RNA点样过程中，样品是在电泳缓冲液液略低于胶表面而不是在高过胶面时加进齿槽，避免了加样时RNA 的扩散、加样后RNA 从齿槽逸出造成RNA的弥散及定位不良等现象。电3-5min 让RNA进入凝胶后再加电泳缓冲液液高过表面，确保了加到每个槽中的RNA量及定位的准确性，从而有利于RNA的鉴定和纯化。(亦适合于DNA)。其他1.? ? ? 超滤对于按照分子量进行初分离的效果不是很好，但很适合用于蛋白的浓缩，更换缓冲液和除盐。2.? ? ? 蛋白质纯化时，蛋白质降解可能与超声破菌保持冰浴有关，之前建议加PMSF（剧毒，蛋白降解抑制剂），建议在上柱子洗脱的时候也加PMSF，一定要用之前再加。3.? ? ? 垂直电泳时，可在电泳糟中放入青霉素小瓶等，可使液面提高而不影响电泳，又很节约电泳缓冲液。4.? ? ? 柱层析时，如果样品较多，可以将样放在三角瓶中，用一个输液管与柱上端连通，并持平，用枪头引导液体流出，