黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞miRNA378和miRNA378表达的影响.doc

黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞miRNA378和miRNA378表达的影响 中国应用生理学杂志，xx，33(1影响D青岛，青岛大学，xx8-19110J SongY，Jin SJ，Cui LH，et a1Immunomodu latoryeffect ofstichopus japonicasacid mucopolysaharideon experimentalhepatocellu larcarcinoma inratsJMolecules，xx，18 (6)7179719311刘永惠，华莎，夏欣欣，等肿瘤及其手术后、放化疗中的中医药辨治临床探究J陕西中医，xx，33 (4)46146312赵欣，白伟，房涛中药抗肿瘤机制的研究进展J广东医学，xx，35 (3)466469113J MKPD，DNSVR，Koppa lS，et a1Ef ficacyof rebamipideand levamisolein thetreatment ofpatients withrecurrent aphthous ulcer-a parativestudyJJ ClinDiagn Res，55xx，8 (11)119122114Sumathi，Shanthi B，PaJ aneeswariMS，et u1Signif icanceof ferritinin recurrentoral ulcerationlJ J，ain DiagnRes，xx，8 (3)141515王先丽，陈龙菊富硒板党对老龄大鼠免疫功能的影响及其机制J中国应用生理学杂志，xx，30 (5)4014O416田小霞，张慧英，王黎敏，等复合致病因素诱导肝硬化大鼠rIFd和TGF-131的动态变化J中国应用生理学杂志，xx，32 (1)6564117J MoroGarcia MA，AlonsoArias R，Ipez-arrea CWhen AgingReaches CIMT-CeHs Phenotypicand FunctionalChangeslJ JFront Immunul，xx， (4)107黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞miRNA378和miRNA378表达的影响万莹，王羽，崔晓雪，冯静宜，龙杰，刘永峰，赵明(】内蒙古民族大学，2内蒙古民族大学附属医院，通辽028000)【摘要】目的研究柯萨奇B3病毒(CVB3)感染乳鼠心肌细胞miRNA378和miRNA378表达的作用。 方法原代培养乳鼠心肌细胞分3组(n=6)对照纽(正常细胞)、CVB感染组(正常细胞+CVB3)、黄芪总黄酮组(正常细胞+CVB3+黄芪总黄酮)。 CVB感染组感染CVB3，黄芪总黄酮组感染CVB3同时给予黄芪总黄酮20mgL。 采用免疫组化方法检测乳鼠心室肌细胞SMA蛋白，实时荧光定量PCR技术检测各组心肌细胞miRNA378及miRNA378表达。 结果与对照纽相比较，CVB感染组心肌细胞miRNA378及miRNA378表达明显减少(P001)；与CVB感染组比较，黄芪总黄酮心肌细胞miRNA378及miRNA378表达明显增加(P001)。 结论黄芪总黄酮可以减少CVB3感染心肌细胞miRNA378及miRNA378表达。 【关键词】柯萨奇B3病毒；黄芪总黄酮；乳鼠；miRNA378；nf iRNA378【KEY WORD】coxsackie virusB3；total f lavonoids ofastraga lus；suckling mousemyoeardium，miRNA378；miRNA378【】R3313；R332【】A【】10006834 (xx)0105503【DOI】1012047jcjap5379xx013病毒性心肌炎(virahnyocarditis，VMC)是由病毒(主要由柯萨奇病毒引起，另有腺病毒、肠道病毒、EB病毒、人疱疹病毒、细小病毒B19和巨细胞病毒等)侵犯心脏引起的心肌实质或间质的局限性或弥漫性病变?1，其中心肌组织严重而广泛的炎症反应导致心肌收缩力急剧下降引起心力衰竭，是引起患者死亡的重要原因l2，3J。 microRNAs(miRNAs)是一类长约22个核苷酸的非编码小分子RNA，通过与靶蛋白mRNA3端非编码区的不完全互补结合，抑制靶mRNA转录后的表达。 研究表明miRNA参与心肌发育、心肌肥大等病理过程_4J。 miRNA一378和miRNA-378的产物，叫正义链和反义链，microRNA前体有发卡结构在成熟过程中发卡结构被剪掉形成miRNA一378和miRNA-378，也叫左臂和右臂l6J。 文【基金项目】国家自然科学基金课题 (81360587)【】xx1116【修回Et期】xx1019【通讯作者E-maillangzhe73163son，dr liudanialgmaileorf l献报道miRNA-378和miRNA一378调控心肌重塑与心力衰竭发生密切相关_5J。 黄芪总黄酮(tota lflavonoidsof Astragalus，TVA)是从蒙古黄芪中分离出的主要活性成分J。 本研究团队在前期研究中发现TFA明显改善柯萨奇B3病毒(coxsackievirus B3，CVB3)所致病毒性心肌炎小鼠心肌病理改变和超微结构l8J，但作用机制尚未明确。 本研究拟观察TFA对CVB3感染乳鼠心肌细胞miRNA378及miRNA378表达影响，阐明TFA改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠的发病机制。 1材料与方法11动物药品与仪器13d Balbe新生乳鼠购置吉林大学基础医学院动物中心，许可证号scxk(吉)xx-0004；Hela细胞由内蒙古民族大学医学院提供。 Super MMLV反转录酶(BioTeke)公司，RNA simpleTota l RNAKit试剂盒(TIANGEN)公司，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；CVB3，Woodn f亲心肌株由56吉林大学农牧学院提供。 12柯萨奇B3病毒感染心肌细胞模型制备121病毒扩增人宫颈癌细胞(Hela细胞)用含10小牛血清的DMEM培养液培养，在对数生长期接种病毒，当90的细胞出现细胞病变效应后，收集病毒液，重复3次，病毒悬液分装于一80保存。 用Reed-Mnench法测定病毒滴度。 122乳鼠心肌细胞的分离与培养将乳鼠心脏放入培养皿中，用PBS反复清洗。 将清洗后的心脏组织剪碎至13mm3小块。 加入011I型胶原酶以及01胰蛋白酶混合液，37消化25min。 消化好后将其移入15ll1l离心管1500rr ain离心7min去上清。 用PBS重悬沉淀，用吸管反复吹打后1000rmin离心5min，用培养基重悬细胞，过200目筛网去除大块组织。 PBS清洗细胞2次，1000rr ain离心10min，去上清，留沉淀。 加入1ml的培养基重悬细胞，细胞计数后放置到培养板中。 成纤维细胞贴壁较快，2h差速贴壁法可去除大量的成纤维细胞，上清悬液中为较纯的心肌细胞。 细胞静置培养24h，随后每2天换一次液。 培养细胞至密度为90左右，PBS清洗2次。 按实验内容将细胞接种于6孔板中，细胞浓度为5lO4celsml，置于37，5co的培养箱内培养过夜。 24h可进行转染，细胞密度一般在70为宜。 123免疫组织化学方法鉴定乳鼠培养心肌细胞各组乳鼠培养心肌细胞进行免疫组化鉴定01TritonX-100孵育；3过氧化氢孵育；血清封闭；一抗孵育；二抗孵育；辣根酶标记；DAB显色；苏木素复染；镜检。 124黄芪总黄酮对感染CVB3的乳鼠心肌细胞作用的观察乳鼠心肌细胞按照细胞浓度为5X lO4cellsml接种于6孔板，并将其置于37，5co培养箱内培养，心肌细胞随机分成3组，每组3孔，取2组细胞与100PFU的CVB3共同孵育1h，弃上清后，其中一组加入正常培养液作为CVB感染组；另一组加入正常培养液，并加入黄芪总黄酮20ncL作为黄芪总黄酮组(剂量参照之前的验证)_8；设立细胞对照组(仅加入培养液，不进行病毒感染)，将3组心肌细胞在37，CO培养箱中培养3d。 13Real timePCR检测各组心肌细胞miRNA378及miRNA378表达经下列实验步骤样本总RNA提取；RNA浓度检测；反转录；荧光定量PCR检测。 每种样本每个基因进行4个复孔平行实验，实验重复3次(n=3)实验数据的选取，是舍去误差较大的数值，取剩余数值的平均值作为最终实验保留数据，利用2-(i T方法分析数据(表1)。 Tab1CVB injuredcardiomyocytes modelpreparation OD260OD280Purity ofDNA wasassessed；CVBCoxsackievirus BASTAstragalus14统计学方法实验结果以均数标准差(孟s)表示，采用SSPS115统计分析软件进行数据分析，不同组间采用配对t检验。 2结果realtime quantitativePCR(x5n=6)CVBCoxsackievims BASTAstragalUSP(001s controlgroup；P001嘴CVB group3讨论心脏重构是心脏在对抗外界因素所致的压力和阻力时为了维持稳态而进行自身调节的适应性过程，如果所致压力和阻力作用持续存在，这种过程可发展为不可逆作用，同时在细胞和细胞外水平可发生凋亡、坏死和纤维化等变化。 本团队发现病毒性心肌炎时内质网应激介导了心肌细胞凋亡，并且黄芪总黄酮对病毒性心肌炎心力衰竭小鼠内质网应激介导的心肌细胞凋亡有保护作用。 文献报道miRNA一 133、miRNA- 1、m；RNA一 21、miRNA一 208、miRNA一29等都参与心肌重构，而且miRNA一146b直接参与病毒性心肌炎的病理学发病过程。 研究发现miRNA一378通过影响转化因子8l(TGF1)分泌而参与心肌纤维化过程_9J，抑制miRNA-378表达能诱导小鼠心肌纤维化【1o，重度心力衰竭患者miRNA-378和miRNA一378表达显著下降。 随着患者心功能好转，miRNA一378和miRNA-378表达也明显增加LH J。 黄芪总黄酮通过干预病毒性心肌炎miRNA一378和miRNA一378表达来影响心肌重构，进而改善病毒性心肌炎导致的心脏功能下降。 中国应用生理学杂志，xx，33(1本实验观察到黄芪总黄酮通过干预病毒性心肌炎miRNA-378和miRNA一378表达来影响心肌重构，进而改善病毒性心肌炎导致的心脏功能下降。 揭示了黄芪总黄酮对病毒性心肌炎作用产生机制，为传统药物走向现代化提供了理论基础。 而miRNA378及miRNA一378表达是如何调控病毒性心肌炎所致心肌重构还需在以后的实验中进一步阐明。 【参考文献】1Lv S，Ra ngJ，Ren S，et a1Epidemiology anddiagnosis ofviral myocarditisJHelleni cJ Cardiol，xx，54 (5)3823912Wei J，Gao DF，Wang H，et a1Impairment ofmyocardial mitochondriain viralmyocardial disease andits reflective window inperiphera lcellsJPLoS One，xx，9 (12)el162393谭振宇，杨大浩，廖春燕主动脉内球囊反搏对急性重症心肌炎心力衰竭患者室性心律失常的影响J岭南心血管病杂志，xx，19 (5)5655674李歆跃，杨巍心脏重构中微RNA的作用J医学综述，xx，21 (2)5825845Lok SI，de JongeN，van KuikJ，et a1MicmRNA Expression inMyoca rdia lTissue an dPlasma ofPatients with EndStage HeartFailure during LVADSupport Comparisonof Continuousand PulsatileDevices lJ jPloS One，xx，1057 (10)eO1364046赵明，单晓彤，赵亚红，等阿霉素损伤心肌细胞miRNA-378和miRNA一378与ca lumenin，GRP78，bax及ba12相关性研究J临床心血管病志，xx，32 (6)6036O6l7j ZhouX，Xin Q，Wa ngY，et a1TotalFlavonoids ofAsiaga lusPlays aCardioprotective Rolein Viral MyocarditisJActa Cardl Sin，xx，32 (1)81888巴金华，窦忠霞，柳文清，等黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒所致病毒性心肌炎小鼠心肌病理改变和超微结构的影响J中国心血管病究，xx，11 (11)91091219Naga lingamRS，Sundaresan NR，Noor M，et a1Deficiency ofca rdiomyocyte-sp ecif icmicroRNA-378contr ibutesto the de-velopment ofca rdiacf ibrosisinvolving atransforming growthfactor8(TGFI)一dependent paracr inemechanism lJJ，成一ol Chem，xx，289 (39)271992721410Naga lingamRS，Sundaresan NR，Gupta MP，et a1A Cardiacenriched microRNA，miR-378，blocks cardiachyper trophy byta rgetingRas signa lingJI，Biol Chem，xx，288 (16)112161123211Ooi JY，Bemardo BC，McMullen JRThe therap euticpotential ofmiRNAs regulatedin settingsof physiological cardiachypertrophyJFuture MedChem，xx，6 (2)205222籽鹅不同等级卵泡生殖相关激素受体基因的表达计红，马莉，张伟宏，李悦，连帅，郭文晋，袁建斌，郭景茹，刘艳芝，甄莉，杨焕民(黑龙江八一农垦大学，大庆163319)【摘要】目的检测籽鹅不同等级卵泡不同生殖相关激素受体mRNA的表达。 方法选用1只8月龄产蛋期籽鹅，处死后分离各级别卵泡(F 1、F 2、F 3、F 5、SYF、LwF)，采用实时荧光定量PCR方法检测促卵泡激素受体(FSHR)、促黄体生成素受体(LHR)、雌激素受体a(ERn)、雌激素受体p(E邸)、生长激素受体(GHR)和胰岛素样生长因子结合蛋白1(