微生物检验操作规程.doc

微生物检验操作规程1. 目的建立微生物检验标准操作规程，保证检验操作规范化。2. 范围适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。3. 职责3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程；3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。4. 操作规程4.1 微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤4.1.1 一般的玻璃器皿（例如培养皿、试管、三角瓶等），可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢，然后用自来水、蒸馏水充分冲洗，直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜，即器壁既不挂水珠也无条纹，即洗涤达到标准。4.1.2 玻璃器皿内有污迹不能洗净时，可浸泡于洗液中，待器皿中有机物氧化分解后，取出用自来水、蒸馏水冲洗干净，备用。4.1.3 新购的玻璃器皿先用2盐酸浸泡，再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。4.2 器皿的包扎4.2.1 试管：塞上胶塞，然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。做发酵试验时，将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。4.2.2 三角瓶、抽滤瓶：将三角瓶（抽滤瓶）口塞上胶塞，然后用牛皮纸把塞头部包起来。4.2.3 吸管：将耐高温的移液枪头装盒，用用牛皮纸或报纸包裹。4.2.4 平皿：10个为一组，用牛皮纸包裹。4.3消毒和灭菌：4.3.1 化学灭菌：此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。如人手等。（1）用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。（2）一般用12%的甲醛液浸泡软管和用具。（3）一般成品漂白粉的有效成分是2532% 。使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内，（对金属有腐蚀作用）放置1015min后冲洗即可。（4）氯灭菌剂的能力以有效氯表示，将氯水配制成50100PPm 的有效氯溶液，可用于浸泡，冲洗和表面杀菌。但氯对金属有腐蚀作用。4.3.2 物理灭菌：4.3.2.1 干热灭菌：适用于干燥的玻璃器皿（吸管、平皿等）、金属器具（镊子等）、固体试液、液状石蜡等。灭菌条件一般选用在160干热空气灭菌2h。（1）器具用牛皮纸或灭菌袋包（装）扎，放入金属容器内。（2）器具在干燥箱加热前放入，每个器具之间留有足够的空隙，使热空气能畅通。（3）关闭箱门接通电源，打开通气孔，使箱内湿空气能逸出，至箱内温度达到100时关闭。（4）加热至160，保持2小时。（5）切断电源，冷却至60 时，打开箱门，取出灭菌器具，并打开箱顶通气口。注：灭菌时必须注意温度不能超过180，以免使棉花、报纸烘焦；灭菌时不得打开箱门；干燥箱未冷却时，不要取出里面器具，防止内外温差过大造成玻璃器具爆炸璃器具爆炸。4.3.2.2 湿热灭菌：适用于容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损伤的物品。详见压力蒸汽灭菌器操作规程。（1）装入培养基的瓶用胶塞盖上，再用牛皮纸包扎。（2）瓶中的培养液不要超过1L，否则灭菌不彻底。（3）容器的上部应留有足够的空间（一般不超过装量的2/3），以便产生气泡。（4）器具用牛皮纸包裹。（5）器具的组合和包裹应允许灭菌蒸汽接触所用物品。（6）各类器具装入灭菌器时，相互间要留有空隙以使蒸汽自由流动。4.4 无菌操作的准备工作及注意事项4.4.1 微生物室应定期按微生物实验室管理规程清洁。4.4.2 微生物室使用前，应先打开紫外灯灭菌2030min。4.4.3 微生物室应备有专用剪刀、镊子、接种针，每次使用前后应灭菌消毒。4.4.4 微生物室应备有75%酒精棉球；新洁尔灭消毒液内浸纱布数块，备用。4.4.5 进入微生物，换专用鞋，穿好洁净服，离室时脱去洁净服和专用鞋，洁净服和专用鞋只准在微生物室内使用，不准穿到其它地方去，并定期洗换和消毒灭菌。4.4.6 样品检验前应在原始记录本上记录名称、批号等内容，并在所用平皿或试管上详细记录样品序号、检验日期等内容。4.4.7 无菌操作前，用75%的酒精棉球擦手。4.4.8 操作要正确迅速，所用的器皿均应是经过严格灭菌的器皿。4.4.9 检验完毕，立即清理工作台，弃去不需要物品，打开紫外灯灭菌2030min。4.5 微生物检验用培养基、溶液的配制、使用与储存配制方法参见培养基说明书或检验标准项下规定配制。4.5.1 水：电导率在25时不超过25s/cm，除非另有规定要求。4.5.2 称重和溶解：保存培养基的时间需视培养基中水份蒸发的程度及有无污染而定，已制备好的培养基要保存于冰箱中。在冰箱中存放的培养基在使用前要先置于室温30min，使其与室温一致再使用，因为气体的溶解度可因温度上升而降低，特别是乳糖胆盐发酵管内的倒管会因温度上升而出现气泡，这一点必须注意。4.5.3 pH 的测定和调整： 用pH计测pH，必要时在灭菌前进行调整，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25时，pH应在标准pH0.2范围内。一般使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L（约1mol/L）的盐酸溶液调整培养基的pH。4.5.4 分装：将配好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积应比培养基体积最少大20%。4.5.6 培养基的使用：经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间，融化后避免过度加热。融化后应短暂置于室温中（如2 min）以避免玻璃瓶破碎。 融化后的培养基放入4750的恒温水浴锅中冷却保温，且应尽快使用，放置时间一般不应超过4 h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培养基尤应注意，融化后保温时间应尽量缩短，如有特定要求可参考指定的标准。 4.5.7平板的制备和储存 倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少为3 mm（直径90 mm的平皿，通常要加入18 mL20 mL琼脂培养基）。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。如果平板需储存，或者培养时间超过48h或培养温度高于40，则需要倾注更多的培养基。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）53冰箱的密封袋中，以防止培养基成分的改变。在平板底部或侧边做好标记，标记的内容包括名称、制备日期和（或）有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。 将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生，平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对培养基表面进行干燥处理。 对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱或培养箱中（温度设为2550）；或放在有对流的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。4.6 检验方法做样前，将灭菌好的吸管、培养皿等放入操作台上，操作台、微生物室紫外线灭菌30min，然后关紫外线灭菌灯，开启净风循环30min后开始做样。详见附录各检测方法附录1 菌落总数测定附录2 霉菌和酵母计数附录3 大肠菌群计数附录4 大肠埃希氏菌计数附录5 沙门氏菌检验附录6 金黄色葡萄球菌检验附录1 菌落总数的测定方法1. 样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水中均质1 min2 min制成1:10 的样品匀液。1.2液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。1.3 用1mL微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。1.4 按4.6.1.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸头。1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。1.6 及时将15mL20mL冷却至46的平板计数琼脂培养基（可放置461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。2. 培养2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，361培养48h2h。2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按4.6.1.2.1条件进行培养。2.3 菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。2.3.1选取菌落数在30CFU300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。2.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。2.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。3 结果与报告3.1菌落总数的计算方法3.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。3.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：N=Cn1+0.1n2d式中：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。3.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。3.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。3.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.2 菌落总数的报告3.2.1 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。3.2.2 菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。3.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。3.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。3.2.5 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。附录2霉菌和酵母菌计数1. 样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即1:10稀释液。1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.3 取1mL1:10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中, 另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，此液为1:100稀释液。1.4 按1.3 操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。1.6 及时将15mL20mL冷却至46的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。2. 培养待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养5d，观察并记录。3. 菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（CFU）表示。选取菌落数在10CFU150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。4. 结果与报告4.1 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。4.1.2 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。4.1.3 若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。4.1.4 若所有稀释度平板均无菌生长，则以小于1乘最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。4.2 报告4.2.1 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。4.2.2 菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。4.2.3 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。附件A菌落总数、霉菌及酵母数检验流程图附录3大肠菌群计数第一法 MPN计数1. 样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水均质1min2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋制成1:10 的样品匀液。1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.3 样品匀液的pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。2. 初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），361 培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。3. 复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，361培养48h2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。4. 大肠菌群最可能数（MPN）的报告按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附件B，表1），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。第二法 平板计数法1. 样品的稀释按第一法中的1进行。2. 平板计数2.1 选取2个3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。2.2 及时将15mL20mL冷至46的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于361培养18h24h。2.3 平板菌落数的选择选取菌落数在15CFU150CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。3. 证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361培养24h48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。4. 大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以2.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。附件B表1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN95%置信区间阳性管数MPN95%置信区间0.100.010.001上限下限0.100.010.001上限下限0000001111111122222200112300011223000111010100012010100120123.03.03.06.16.29.43.67.2117.4111115169.21420152027-0.150.151.21.23.60.171.33.61.33.63.64.54.51.43.64.53.74.58.79.59.61118183818183820384242423842424242942222233333333333333322233000111122223333012010120123012301232128352936233864437512016093150210290240460110011004.58.78.78.78.74.68.71791737401837409042901804204294949494941101801802004204204204204301000100020004100注1：本表采用3个稀释度0.1g (mL)、0.01g (mL)和0.001g (mL)，每个稀释接种3管。注2：表内所列检样量如改用1g (mL)、0.1g (mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g (mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。附件 C大肠菌群计数检验流程图第一法 MPN计数法 第二法 平板计数法附录4大肠埃希氏菌计数第一法 MPN计数法1. 样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水均质1min2min,制成1:10 的样品匀液。1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.3 样品匀液的pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。2. 初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），361 培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h2h，产气者进行复发酵试验。产气者进行复发酵试验。如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN 结果。3. 复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45的EC 肉汤管中，放入带盖的44.50.2水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h2h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h2h。记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。4. 伊红美蓝平板分离培养轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，361培养18h24h。观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。5. 营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，361，培养18h24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。6. 鉴定取培养物进行靛基质试验、MR（甲基红）-VP试验和柠檬酸盐利用试验（详见生化试剂盒使用）。5.3 大肠埃希氏菌MPN 计数的报告大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为或。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表（见附件D，表2），报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。第二法 平板计数法1. 样品稀释按第一法中的1进行2. 平板计数2.1 选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。2.2 将10mL15mL冷至450.5的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3mL4mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，361培养18h24h。2.3 平板菌落数的选择选择菌落数在10CFU100CFU之间的平板，暗室中360nm366nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC 25922）和产气肠杆菌（如ATCC 13048）做阳性和阴性对照。3. 大肠埃希氏菌平板计数的报告两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g (mL)表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。附件D 表2 大肠埃希氏菌最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN95%置信区间阳性管数MPN95%置信区间0.100.010.001上限下限0.100.010.001上限下限0000001111111122222200112300011223000111010100012010100120123.03.03.06.16.29.43.67.2117.4111115169.21420152027-0.150.151.21.23.60.171.33.61.33.63.64.54.51.43.64.53.74.58.79.59.61118183818183820384242423842424242942222233333333333333322233000111122223333012010120123012301232128352936233864437512016093150210290240460110011004.58.78.78.78.74.68.71791737401837409042901804204294949494941101801802004204204204204301000100020004100注1：本表采用3个稀释度0.1g (mL)、0.01g (mL)和0.001g (mL)，每个稀释接种3管。注2：表内所列检样量如改用1g (mL)、0.1g (mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g (mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。附件E大肠埃希氏菌计数检验流程图第一法 MPN计数 第二法 平板计数法附录5 沙门氏菌检验1. 前增菌称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的容器中，均质1min2 min。若样品为液态，振荡混匀。如需测定pH 值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.80.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，于361培养8h18h。如为冷冻产品，应在45以下不超过15min，或25不超过18h解冻。2. 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB 内，于421培养18h24h。同时，另取1mL，转种于10mL SC内，于361培养18h24h。3. 分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD 琼脂平板。于361分别培养18h24h（XLD 琼脂平板）或40h48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表3：表3 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落形态选择性琼脂平板沙门氏菌BS 琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。XLD 琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。4. 生化试验4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接营养琼脂平板，于361培养18h24h，必要时可延长至48h。4.2 用接种针挑取营养琼脂平板纯培养物，分别接种赖氨酸和赖氨酸对照管，361培养18h24h。 在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表4。表4 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱酸酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA（）（）可疑沙门氏菌属KA（）（）可疑沙门氏菌属AA（）（）可疑沙门氏菌属AA/非沙门氏菌KK/非沙门氏菌注： K（产碱，红色）；A（产酸，黄色）；产气（断层）；产硫化氢（变黑）（阳性，）；（阴性）；（）：多数阳性，少数阴性；/：阳性或阴性。4.3 当三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验的初步判断为可疑沙门氏菌属时，用接种环挑取（较大菌落取一半菌落，小菌落取一个）营养琼脂平板纯培养物，接种到3mL无菌水中，振摇制成约0.5麦氏浊度菌悬液，用无菌吸管接种于沙门氏菌干制生化鉴定盒（北京路桥）的9个圆孔中，每孔0.2mL菌悬液，盖上盒盖，于36 1 培养。各生化反应的培养及结果见表5、表6。注：将已挑菌落的平板储存于25或室温至少保留24h，以备必要时复查。表5 生化试剂盒（北京路桥）结果判定表试验项目结果判定沙门氏菌生化现象培养时间说明备注阴性结果阳性结果氨基酸对照黄色18h24h接种后需滴加2-3滴灭菌液体石蜡覆盖培养及表面出现黄色即为阴性赖氨酸脱羧酶对照管黄色对照管黄色阳性或阴性试验管黄色试验管紫色氰化钾对照生长24h48h生长为混浊氰化钾对照管生长对照管生长不生长试验管不生长试验管生长靛基质黄色玫瑰红色大多数阴性18h24h培养后滴加2-3滴靛基质试剂，即刻观察。-尿素黄色或橙色玫瑰红色或红色18h24h-甘露醇蓝色或绿色黄色阳性18h24h-山梨醇大多数阳性ONPG不变色黄色阳性或阴性1h3h和24h-表6 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH 7.2 尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶A1A2A3/注：阳性；阴性；/阳性或阴性。4.3.1 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表7可判定为沙门氏菌。 如有2 项异常为非沙门氏菌。表7 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH 7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判 定 结 果甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）沙门氏菌或（要求符合本群生化特性）沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：表示阳性；表示阴性。4.3.2 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。4.3.3 反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌。大部分沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。4.5 血清学鉴定4.5.1 抗原的准备一般采用1.21.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如23）培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在0.550.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.30.4半固体琼脂的小玻管1 次2次，自远端取菌培养后再检查。4.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定在玻片上划出2个约1 cm2 cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。1.6 结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。附录6 金黄色葡萄球菌检验第一法 金黄色葡萄球菌定性检验1 操作步骤1.1 样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤容器中，均质1min2 min。若样品为液态，吸取25mL 样品至盛有225mL7.5 %氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。1.2 增菌和分离培养1.2.1 将上述样品匀液于361培养18h24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。 1.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板361培养18 h24 h。Baird-Parker平板361培养18h24h或45h48h。1.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。1.3 鉴定1.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5m1m。1.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，361培养18h24h。取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2mL0.3 mL，振荡摇匀，置361 温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，361培养18h48h，重复试验。1.5 结果与报告1.5.1结果判定：符合1.2.3、1.3，可判定为金黄色葡萄球菌。1.5.2结果报告：在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。第二法 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数2 操作步骤2.1 样品的稀释2.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的容器内，均质1min2min，制成1:10的样品匀液。2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。2.1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液