【毕业学位论文】（Word原稿）牛饲料转化效率分子遗传标记的研究动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 牛饲料转化效率分子遗传标记的研究 目 录 摘要（中文） I 摘要（英文） 中英文 缩写 第一章 文献综述 1 言 1 料转化效率的数量遗传 4 料转化效率的生化遗传 4 料转化效率的分子遗传 6 题与展望 18 究的意义 19 第二章 饲养试验 20 材料与方法 20 计与分析 22 结果与分析 22 结果与讨论 25 结论 27 第三章 分子生物学实验 28 材料与方法 28 实验步骤 31 统计与分析 40 结果与分析 42 因多态性的相关性分析 49 果与讨论 59 参考文献 67 致谢 74 作者简介 75 附录 76 I 牛饲料转化效率分子遗传标记的研究 （摘要） 本实验通过对西门塔尔杂交牛、海福特、安格斯牛、西门塔尔、荷斯坦、鲁西黄牛六个群体组成 的 308头生长牛饲料转化效率和肉质性状的测定，传统的饲养实验结合分子遗传标记技术，讨论 品种间的的差别。并 于五条染色体上选择类胰岛素样生长因子八个基因位点进行饲料转化效率性状和肉质性状的分子遗传标记分析，研究各个位点的遗传效应与饲料转化效率、日增重、日采食量、蛋白转化效率、净能转化效率性状的影响及对肉质性状中的大理石花纹、眼肌面积、肉色、眼肉、里脊、外脊的相关性。开展了如下的研究： 1 在饲养实验中，探讨了品种间对 性状的差异性， 获得的结果如下： 种对所有饲料转化性状和肉质性状都有显著的影响。在本实验 的六个品种中，西门塔尔在饲料转化方面是最优秀的，其次，是海福特、安格斯，最差的是鲁西黄牛；在肉质性状方面，本实验共屠宰的三个品种中，安格斯牛大理石 花纹 、眼肌面积、肉色、眼肉、里脊、外脊比较优秀。 国的鲁西黄牛在饲料蛋白转化效率方面与国外的肉牛品种处于相同的水平，这说明鲁西黄牛完全可以选育成与安格斯、海福特一样优秀的肉牛品种。 在大规模育种实施此方案中，对饲料转化效率的选择是通过生长速度来间接选择的。本试验表明：饲料转化效率与日增重之间的相关为 2 在分子生物学实验中，通过 分子遗传标记技术，探讨基因多态性与目的性状之间的相关性，获得的结果如下： 在总群体中，品种效应对饲料转化性状和肉质性状 (上脑除外 )的影响均达到极显著水平（ 500 与胰岛素有 50%的同源性 依赖型。发育：胎儿 出生后 注 :同源性是指 、 B 区分别与胰岛素、链之间进行的比较。 基因表达 称生长介素（ 由 70 个氨基酸组成的单链碱性多态。不同种属来源 化上高度保守。 因是单拷贝基因，定位在 12号染色体 5个外显子和 4个内含子 ，其长度大于 4 1)。 图 人 因 （ a）基因结构；（ 2）外显子的不通拼接和 3 个可能的起始密码 为在外显子 3/4 和 3/5 之间有一选择拼接位点 ， 可产生两种不同的 称为a b 翻译成两种 其长度分别为 153和 195个氨基酸。在 外显子 1、 2、 3 和 5转录成 a 外显子 1、 2、 3和 4构成 b 于在 5端第 22、 25 和 48 位有 3 个对应于甲硫氨酸的 码子都可作为启动子 ，因此对于这个多肽第一个残基的位置 产生争论。从与胰岛素前体基因同源性方面考虑认为起始位置在 从序列保守性方面考虑认为起始点在 而体外试验支持起始点在 认为第 48 位为起始位点的可能性最大 ， 因为它的邻近序列与真核生物相应的翻译起始位点序列很匹配。因此 ， 翻译产生的 体包括 3 个部分：信号肽 ， 由 48 个氨基酸组成 (第 148 个 )；随后为 70 个氨基酸 (第 49 118 个 )， 由 B、 C、 A、 D 区组成；最后是包括 端的肽段，残基数分别为 35 个 (a)和 77 个 (b)。具体就是 外显子 1编码 21个氨基酸 ， 构成信号肽的一部分 ， 接着为一个约 显子 2有 157个核苷酸 ， 编码 52 个氨基酸 ， 头 27 个氨基酸为信号肽的另一部分。外显子 2 还编码 B 区开始的25个氨基酸 ， 外显子 2的最后一个碱基 (即 6个氨基酸 文献综述 12 处插入了一个内含子 ， 此内含子至少有 21显子 3 编码的是： 区最后 4 个氨基酸残基 (第 1个氨基酸 个碱基 上 )； 2个氨基酸； 1个氨基酸； 个氨基酸； 6个氨基酸 ， 外显子 4和 5各 自编码 b 和 a 肽剩余部分、终止密码子、 3加信号部位。外显子 4中多腺苷酸化信号 6 个核苷酸处。外显子 5中多腺苷酸化信号 9个核苷酸之前。 人 8 个氨基酸的信号肽 ， 是目前发现的最大的非病毒真核细胞信号肽。 端 19个氨基酸 (第 30 48)具有真核细胞信号肽的所有特点 ， 即带有正电荷的 N 端 (第 31 位的丝氨酸 )、 11 个氨基酸的中间疏水核 (第 32 42)以及一组极性氨基酸组成的 第 43 48)。与 信号肽的 9 个氨基酸 (第 1 29)不具有信号肽特性 ，并且它含有 7个带电荷的氨基酸残基 ， 其总静电荷为 +5， 只有很少的信号肽所含静电荷超过 +2。人 人们对于大鼠 因了解得更为清楚。大鼠 因很大 (长度 70k)， 至少包括6 个外显子和 5个内含子 (图 2)。外显子 3和 4编码出成熟 、 C、 区 ， 以及信号肽的 27 个氨基酸和 6 个氨基酸。外显子 1和 2编码出信号肽的剩余部分和 5端非 图 鼠 因 黑色条块为翻译区 翻译序列。外显子 5 和 6 分别编码出 E 肽，外显子 6 编码出 5端非翻译序列。这些 3和 5端不同的外显子分别拼接产生不同的 们的大小在从 主要是由于在外显子 6中不同的腺苷酸化作用的结果。 在大鼠的非肝组织中已确定 2种不同的 它们可译出同样的成熟 但其 5端非翻译区不同 ， 这是由于转录是从位于外显子 1 和 2 中不同的转录起始点开始的。外显子 2 的转录主要 存在于肝中 ， 受 外显子 1显子 1 转录起始位上游启动子区域没有典型的 分 ， 但其启动子结构可被前列腺素 非肝组织产生的 如 ， 雌激素对卵巢、胎盘和骨 ， 促性腺激素对卵巢和辜丸 ， 以及胰岛素对主动脉中的 表达都有调节作用。人们还研究了大鼠 肝和非肝组织中编码不同 E 肽的情况。 编码两种形式的 即无外显子 5序列的 序列的 中 ， 而 在所有组织中也存在 ， 但是主要在肝中表达。另外 ， H 更敏感。对两种 E 肽的氨基酸结构进行比较 ， 发现在 中存在 2个 而在 中并不存在。如图 6所示 ， 外显子 1转录的 8 氨基酸的信号肽 ， 而外显子 2转录的 2氨基酸的信号肽。中国农业科学院硕士学位论文 文献综述 13 信号肽 C 末端 27个氨基酸是相同的 ， 而 编码的 21 个氨基酸和外显子 2 编码的5 个氨基酸不同。由于真核生物信号肽的 N 末端是作为信号肽酶切位点的决定因子。因此 ， 两种信号肽 N 末端的不同就可产生两种不同的分子。外显子 1 编码的 体原可以被信号肽酶切断，生成巳切除 以生成带有完整 分泌到循环中起 近年来，人们在猪 因发现了不同个体、品种间存在着丰富的多态性， 1992） （ 采用 术对杜洛克、汉普夏和约克夏的 因上游约 1200段处进行扩增，经微卫星标记检测发现 6 个等位基因，品种间的基因频率差异极显著 （ 而在里脊性状 合型的效应值明显小于与 合型的效应值，差异达到显著水平（ 在外脊性状 合型的效应值明显小于 与 合型的效应值，差异达到显著水平（ 在对 蛋白转化效率性状中， 异达到显著水平（ 对于眼肌面积性状， 合型的效应值与 合型的效应值、 合型的效应值则均发现显著差异 。但不极显著（ 中国农业科学院硕士学位论文 分子生物学实验 55 表 因的分子多态性位点的 差分析 of 、 种 环境 W 增重 (* * 采食 (* * 料转化效率 (%) * * * * * * 蛋白效率 (%) * * * * 净能转化效率 (%) * * 大理石花纹（级） * 肌面积 (* * * 色（级） * 脑 ( * 肉 (* * * 里脊 ( 脊 ( * 注：十分显著（ P 显著 (P 中国农 业科学院硕士学位论文 分子生物学试验 56 在对 因座位不同基因型的最小二乘效应值分析及差异显著性检验，对于饲料转化性状， 合型的效应值与 合型的效应值有一定的差距，达到极显著水平（ 对于蛋白转化效率性状， A 纯合型的效应值有一定的差距，达到极显著水平。 合型的效应值与 达到显著水平。对于饲 料的净能转化性状， 合型的效应值明显大于 合型的效应值，达到显著水平（ 而在里脊性状 B 纯合型的效应值明显小于与 异达到显著水平（ 在外脊性状 合型的效应值明显小于与 异达到显著水平（ 。所以为将 候选基因提供了进一步依据。 本实验若在 品种内统计，可能存在样本少的限制，结果可靠性不如大群体， 但 本实验品种较多 ,建议在单一品种大群体内进行此项分析，可能对 且 因已经测序完毕， 具体机制 有的仍是未知，可以考虑从该基因的其他区域继续找寻多态性进行分析，以提供 料转化效率 候选基因的更多理论基础。 因与 6 个品种饲料转化效率和肉质性状的关系 在对 因座位不同基因型的最小二乘效应值分析及差异显著性 检验，在蛋白转化效率性状中， 合型的效应值明显大于 异达到显著水平（ 对于眼肌面积性状， 合型的效应值与 合型的效应值、 合型的效应值则均发现显著差异。但不极显著（ 因与 6 个品种饲料转化效率和肉质性状的关系 在对 因座位不同基因型的最小二乘效应值分 析及差异显著性检验，对于饲料转化性状， 合型的效应值与 合型的效应值有一定的差距，达到极显著水平（ 对于蛋白转化效率性状， A 纯合型的效应值有一定的差距，达到极显著水平。 达到显著水平。对于饲料的净能转化性状， A 纯合型的效应值，达到显 著水平（ P 合型的效应值与 达到显著水平。 因与 6 个品种饲料转化效率和肉质性状的关系 在对 因座位不同基因型的最小二乘效应值及差异显著性检验分析，对于日增重 A 纯合型的效应值有一定的差距，达到显著水平（ P 差不大，未达到显著水平。对于眼肌面积性状， B 纯合型的效应值、 极显著的差异。但不极显著（ P 合型的效应值相差不大，差异不显著。对于肉色性状的影响， 合型的效应值明显大于 合型的效应值，具有显著的差异（ P 因与 6 个品种饲料转化效率和肉质性状的关系 在对 因座位不同基因型的最小二乘效应值及差异显著性检验分析，对于日增重 合型的效应值明显大于 合型的效应值、 合型的效应值，对日增重的影响达到极显著水平。但 异不显著。对于饲料转化 性状， 合型的效应值的影响 合型的效应值 合型的效应值，并且都达到极显著水平。对于蛋白转化效率性状， 合型的效应值与 到极显著水平。但 A 纯合型的效应值相差不大，未达到显著水平。对于净能转化效率性状， 合型的效应值与 合型的效应值有一定的差距，达到极显著水平。但 合型的效应值与 达到显著水平。对于眼肌面积性状， 合型的效应值与 则均发现显著的差异。但不极显著（ P 异不显著。对于里脊性状， 合型的效应值与 异不显著。对于中国农业科学院硕士学位论文 分子生物学实验 65 外脊性状， 合型效应值明显大于 合型的效应值，有显著的差异。但不极显著（ P 论 （ 1） 应用 是由于 709 712、 782、 792、795719 754、 790、 803、 804 787 T 的突变造成的； 因 增产物 切 多态性 是由于在 52 T C 的突变， 124 三种 由于在 79， 因型却发生了 T C 的突变， 因型却发生了 T G 的突变， 86， 169B 基因型却发生了 T 566A、 个基因在 、 B。经 同牛品种间在五个多态位点基因型分布存在 极 显著性（ P。 （ 2）应用 析方法在牛的 具有两个等位基因 A、 B， 态的产生是由于碱基的 换造成的，六个牛群体多态位点基因型分布 结果表明：不同牛品种间在五个多态位点基因型分布存在 极 显著性（ P 显著性的差异（ P （ 3）牛的 因在 点上不同基因型之间对饲料转化效率的影响有显著的差异。 对于日增重 性状， 点上 合型的效应值明显小于 合型的效应值，差异达到极显著水平（ P 因座位 在 A 纯合型的效应值达到显著水平（ P 因座位 在 点上 合型的效应值明显大于 合型的效应值 也 达到极显著水平（ P。 对于 蛋白转化效率性状在 异达到显著水平（ P 到极显著水平（ P； 对于饲料转化性状， 到极显著水平（ P与 的效应值的差异达到显著水平（ P 因座位 在 点上 合型的效应值的影响 与 纯合型 P 对于饲料的净能转化性状 ， 到显著水平（ P A 纯合型的效应值、 合型的效应值达到极显著水平（ P。 （ 4）牛的 因在 点上不同基因型之间对肉质性状的影响有显著的差异。 对于 里脊性状 ， 因座位 在 点上 合型的效应值明显小于与 科学院硕士学位论文 分子生物学试验 66 杂合型的效应值，差异达到显著水平（ P。 A 纯合型的效应值与 合型的效应值则均发现极显著的差异 （ P。 对于 外脊性状 ， 因座位 在 异达到显著水平（ P； 因座位 在 大于 合型的效应值，有显著的差异（ P 对 于眼肌面积性状， B、 P； 因座位 在 合型的效应值则均发现极显著的差异（ P。 因座位 在 B 杂合型、 P 对于肉色性状的影响， 点上 合型的 效应值明显大于 有显著的差异（ P。 纵上所述，本研究的结果表明： 因上多态位点的不同基因型之间对本研究的经济性状有 显著的差异 ，可以作为影响饲料转化效率和肉质性状的候选基因。 3. 研究的创新点 从分子水平上评定牛饲料转化效率的遗传特征及其遗传规律，以期 为生产中培育出经济性能良好的畜禽品种和新品系提供理论依据。 采用 法发现在牛的 四外显子由于碱基 G T 的突变引起的 05 因型与原序列一致， 因型却发生了 G A 的突变， 因型发生了 G T 的突变。 用最小二乘法拟合线性模型对 统的基因的 五个多态位点不同基因型之间对生产性状差异的显著性进行了检验，进一步证明类胰岛素生长因子可以作为影响饲料转化效率的候选基因。 为牛的饲料转化效率分子筛选体系的建立进行了初步的探讨。 3. 待解决的问题 （ 1）完成牛 基因全序列的测定。 （ 2）在整个基因范围内寻找多态位点，分析各位点的标记效应对牛 饲料转化效率和肉质 性状的影响、以及各位 点不同的基因型之间生产性状的差异，进一步明确作为影响饲料转化 效率 候选基因的意义。 （ 3）在更多品种的群体中验证变异位点对 饲料转化效率 性状的影响。 （ 4）在 分析所发现的基因上的遗传变异对相应基因的转录子及翻译蛋白含量 或活性的影响，以了解其影响饲料转化 效率的 作用机制。中国农业科学院硕士学位论文 参考文献 67 主要参考文献 1. 秦志锐 奶牛的遗传改良 1991 P： 59. 许尚忠 中国西门塔尔牛选育方法及其决策探讨 中国西门塔尔牛新品种选育 2000 P： 1. 许尚忠 我国畜禽遗传育种研究方向及特点 中国西门塔尔牛新品 种选育 2000P： 14. 常洪、黄泽荣 黄牛育种 1988 中国环境科学出版社 5. 张沅 动物育种各论 北京农业大学出版社 6. 张沅 家畜育种学 中国农业出版社 7. 张沅、张勤 畜禽育种中的线性模型 国农业大学出版社 8. 盛志廉、陈瑶生 数量遗传学 2001 科学出版社 9. 李俊雅 中国西门塔尔牛饲料转化效率的遗传因素分析 林农业大学硕士学位论文 10. 盛树立主编 多肽激素的当代理论和应用 科学技术出版社 11. 许雷主编 分子生物学试验理论与操 作教程 12. 欧阳建华等 鸡胰岛素样生长因子基因的遗传多态性与其体重的关系 畜牧兽医学报 2003 34（ 6） 5253. 刘桂兰、蒋思文等 因的 态性与脂肪沉积相关性状的关联分析 遗传学报 2003 30（ 12） 11074. 冯仰廉主编，反刍动物营养学 2004 科学出版社 15. in of on 995, 52:419 425. 16. 1998). in 625:8117. 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