【毕业学位论文】（Word原稿）瓜枝孢弱致病菌株诱导黄瓜抗病性分子机制的初步研究植物病理学硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 瓜枝孢 弱致病 菌株诱导黄瓜抗病 性 分子机制 的 初步研究 I 摘 要 生物因子诱导的植物抗病性是增强寄主抗病性的重要方法。与病毒相比，真菌、细菌弱致病菌及其诱导抗病机制的研究相对滞后。本论文以本实验室通过高温诱导在国内外首次筛选出的瓜枝孢 (致病菌株为试材，采用 术系统分析了瓜枝孢弱致病菌株基因组的变化，以及瓜枝孢弱致病菌株诱导黄瓜抗病的差异表达，取得如下阶段性进展： 1、通过瓜枝孢弱致病菌株诱导黄瓜抗病性的表型鉴定，进一步验证了瓜枝孢弱致病菌株具有稳定的致弱性，能显著提高黄瓜对黑星病的抗性，诱导抗病效 果达 2、瓜枝孢弱致病菌株 2R 和 3R 的孢子比对应强致病菌株 2Q 和 3Q 的孢子小，形态规则，孢子形状呈椭圆形或近圆形，而对应强致病菌株孢子形状多种多样，有梭形、近梭形、椭圆形及近 圆形等形状。 3、 术可以有效揭示弱致病菌株 平的变异，瓜枝孢经 50高温处理得到的弱致病菌株基因组发生了显著的变化。 256 个 物组合在扩增 2R/2Q 和 3R/3Q 时（ 2Q 和 3Q 为强致病菌株），分别产生 2910 和 2216 个 段产生， 2R 与 2Q 以及 3Q 的遗传相似性分别为 4、筛选并优化了黄瓜 应体系及反应程序。 利用 术分析了瓜枝孢弱致病菌株诱导黄瓜抗病相关基因表达片段的时序特性：差异表达片段在弱致病菌株诱导后的 9 个时间点均有分布 ,弱致病菌株引发的一系列调控始于 3h 或更早， 69h 至 24h 期间变化不明显， 24h 开始显著减少。 5、获得了经 证的瓜枝孢弱致病菌株诱导的 4 个特异 段序列。 4 个特异 段与 一些编码诱导抗病相关基因的 列有较高的同源 性，主要包括梨 酶 亚基 、 黑麦抗病基因 拟南芥水杨酸葡糖基转移酶、磷脂酶 C 等。 上述研究结果，在理论上将为进一步深入研究瓜枝孢弱致病菌株的遗传特性，以及 进一步克隆瓜枝孢弱致病菌株诱导抗病的相关基因奠定基础 ；在实践上将为植物真菌疫苗的研制和开发提供一定的依据。 关键词： 瓜枝孢；弱致病菌株；诱导抗病性；黄瓜；黑星病 by is to a of by of is of in In . by to of in at . in by 1. . by to up 2. of 2R R . or of to 3. . in NA 0 . 2910 216 R/2Q R/3Q (2Q Q 56 of R/2Q R/3Q 4. CR of by in A of by hr or t hr 4of 45. NA by to TP of 1. In a on of . to 录 第一章 绪论 . 1 言 . 1 瓜诱导抗病性研究进展 . 1 黄瓜诱导抗病因子 . 1 黄瓜诱导抗病机理 . 1 黄瓜诱导抗病性的研究展望 . 4 1.3 术在研究植物基因差异表达中的应用 . 5 术的应用 . 5 研究的意义 . 6 第二章 瓜枝孢 弱致病 菌株基因组分析 . 8 料与方法 . 8 枝孢 弱致病 菌株的筛选 . 8 枝孢 弱致病 菌株致病性鉴定 . 8 致病 菌株遗传稳定性研究 . 9 弱致病 菌株基因组分析 . 9 . 9 据处理 . 10 结果与分析 . 10 瓜黑星病弱致病菌的筛选 . 10 枝孢 弱致病 菌株遗传稳定性研究 . 11 枝孢 弱致病 菌株及其 强致病 菌株的差异 . 12 增图谱 . 12 增图谱 . 13 温诱导的 弱致病 菌株与其 强致病 菌株间的遗传相似性 . 14 结 . 15 第三章 瓜枝孢 弱致病 菌株诱导黄瓜抗病差异表达分析 . 17 料与方法 . 17 枝孢 弱致病 菌株诱导抗病性鉴定 . 17 系 . 17 枝孢 弱致病 菌株诱导的 异片段克隆 . 19 异片段测序 . 20 异片段的序列同源性搜索与相似性比对 . 20 异片段 证 . 20 果与分析 . 20 枝孢 弱致病 菌株诱导黄瓜对黑星病抗性的表型鉴定 . 20 瓜 应体系优化 . 21 瓜枝孢 弱致病 菌株诱导黄瓜抗病相关的差异片段的 析 . 23 枝孢 弱致病 菌株诱导黄瓜抗病相关基因的时序表达 . 23 异表达片段的回收和克隆 . 25 异表达片段的测序及同源性比较 . 26 交分析 . 28 结 . 29 第四章 结论与讨论 . 30 论 . 30 验证了瓜枝孢 弱致病 菌株 2R 的致弱性及对黄瓜黑星病的诱导抗病性 . 30 基因组水平分析了高温诱导产生的 弱致病 菌株与 强致病 菌株的差异 . 30 化了黄瓜 应体系 . 30 析了瓜枝孢 弱致病 菌株诱导黄瓜抗病相关基因差异表达的时序性 . 30 获得了经 证的瓜枝孢 弱致病 菌株诱导的 4 个特异 段序列及其同源性比对结果 . 31 论 . 31 瓜枝孢 弱致病 菌株的诱导抗病性 . 31 温诱导产 生的瓜枝孢 弱致病 菌株的基因组分析 . 31 枝孢 弱致病 菌株诱导黄瓜抗病机理研究 . 32 差异显示分析中的应用 . 33 参考文献 . 35 附录 . 40 致谢 . 46 作者简历 . 48 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 言 植物病害是威胁农业生产的自然灾害之一。人类赖以生存的有益植物，如农作物、蔬菜、果树、花卉、林木等，都会不断受到病原微生物 （ 包括真菌、细菌、病毒和类病毒 ） 的侵袭，病害发生严重，造成减产、品质降低、甚至植株死亡，使生产遭受重大的经济损失。目前，农作物病害的防治主要依赖于化学防治，由化学药剂过量使用所造成抗药性问题和环保问题，使其在生产中的应用受到越来越多的限制。因而提高和利用寄主本身的抗病性是增强作物抵御多种病害的根本有效途径。 植物诱导抗病性以其寄主植物获得 的抗性具有广谱性和持久性等特点，成为当前植物病害防御的研究热点之一。 瓜诱导抗病性研究进展 黄瓜诱导抗病因子 诱导因子是指能诱导植物产生抗病反应的物质，主要包括非生物性诱导因子和生物性诱导因子，非生物性诱导因子包括物理因子和化学因子。许多学者先后利用各种诱导因子开展了黄瓜诱导抗性的研究，在已报道的黄瓜诱导抗性研究结果中所涉及的诱导因子包括热击、高温、低温、低湿、重力等物理诱导因子（ A,1984； ,1987； 李宝聚， 2001； 赵欢， 2005； 李宝聚， 2005），水杨酸、苯酚类、乙烯类、磷酸盐等化学诱导因子以及无致病性菌株、 弱致病 菌株等生物诱导因子（云兴福， 2000； .,1991 ；沈其荣 ， 2000； ， 1995； S， 2004； J,1995； 邱驰等 ， 2005；王晨芳 ， 2005； 马青 ， 2003， 2004； 魏国强， 2004；郭海渊， 2005）。研究结果表明：利用水杨酸、乙烯、紫外线等非生物性因子以及细菌、真菌和病毒及它们的代谢产物等作为诱导因子，均能提高黄瓜对霜霉病、白粉病、黑星病、炭疽病等病害的抗病能力 李淑菊， 1997；栗波， 1994；王维荣， 1994）。 此外，微量元素、硅、烟酸衍生物等诱导因子也有报道 (， 1995； ， 1992； J， 1995； P， 1990； ， 1995)。 黄瓜诱导抗病机理 诱导抗病机理主要是诱导剂影响植物和病原物之间的关系，以某种方式改变了植物代谢，使植物的生长向有利于抗病方向发展。近来来 , 分子生物学技术的发展日新跃益 ， 对植物病害诱导防御技术的研究日渐深入， 但诱导抗性的免疫机制是复杂的。目前研究较深入的中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 诱导抗病机理大多集中在拟南芥和烟草等模式植物上，黄瓜诱导抗病机理的研究还不是很深入。本文将从多方面对黄瓜诱导抗病性的机理进行阐述。 构物质变化 经诱导剂处理的黄瓜植株，其部分结构组成物质会发生一定的变化，主要表现在角质、乳突、侵填体 、胼胝质、胶质物质的形成及木质化的产生，在一定程度上改变了黄瓜的形态结构，增强了诱导后黄瓜植株远离侵染点的细胞壁和表皮组织的木质化能力，在病原菌和植株间形成一种屏蔽，从而阻止病原菌的进一步侵染，使病菌的致病过程受到抑制，因而有助于提高黄瓜对病原物的抗性。 研究发现在接种黄瓜疮痂病后，抗病黄瓜品种的下胚轴皮层 (接种 5天后 )具有木质素沉积 ,而在感病的和健康的黄瓜下胚轴中则没有，推测木质化作用可作为抗病的一种因素。 任何刺激寄主在侵染点产生木质化的物质，都能增加植物对病害的抗性（ 1995） 。木质素 合成量的提高正是植物抗性潜能被激活的结果 ( 1987)。用非致病菌接种植物后，可刺激植物在维管束形成侵填体和胶质物质，阻止病菌在维管束中的扩展。如用导侵填体和胶质物质形成，阻止了根部病菌f. 陈捷 , 1994） 。 用氨基寡聚素处理黄瓜叶片后 ,可以诱导黄瓜产生对白粉病的抗病性 ,表现为细胞壁加厚 ,寄主细胞壁下产生多层次结构的乳突， 乳突的大量产生阻止 了该菌菌丝侵入黄瓜叶片中 （ 马青 ， 2004） 。 组织结构抗病性是黄瓜抵御病原菌侵染的第一道屏障，可以有效抑制病原菌的进一步侵染。 活性变化 植物在诱导因子作用下，植株体内有多种抗病相关酶活性发生变化。主要包括，苯丙氨酸解氨酶（ 过氧化物酶（ 超氧化物歧化酶（ 多酚氧化酶（ 脂氧合酶 （ 酶类。黄瓜经诱导处理后体内 性明显增强 (,1982; ,1982； A, 1984)， 化苯丙氨酸向 肉桂酸转变是木质素合成的起点，而且该酶也是酚类代谢、木质素和植保素合成中的关键酶。 其同工酶参与植物细胞壁蛋白的交联反应和木质素的合成。它利用体内的 而阻止病原菌侵染。 能将 酚类物质氧化成醌类物质，起到杀菌作用。植物感病后，体内会产生过多的活性氧，主要有 氧阴离子）和 氧化氢）。 要用来清 除 转而把 化为 2。 李冠等人（ 1989）在诱导免疫的哈密瓜植株中发现， 其它两个苯丙烷类代谢的关键酶同步升高。 李洪莲等用激 发子和诱抗菌处理黄瓜后，发现植物体内 且对 炭疽病表现有抗性。其中 功酶带数增加，着色加深，这说明诱导抗性的产生与上述酶活性的增强有关 （ 李 洪连 ， 1993） 。 A 等（ 1993）报中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 道，用 诱导黄瓜的系统抗病性， 性增强。 魏国强（ 2004）用硅诱导接种能使黄瓜叶片的过氧化氢酶 （ 、过氧化物酶 （ 活性升高 ,超氧化物歧化酶 （ 活性降低 。 诱导黄瓜幼苗对白粉病的抗性。 物抗毒素物质变化 植物抗毒素（ 病原菌侵入寄主时，寄主细胞产生抑制病原菌生长的物质。在黄瓜抗病研究中发现的抗毒素种类主要有酚类物质、类黄酮等。酚类物质（单宁、绿原酸等）是杀菌性物质，又是木质素合成的前体，故能抗病。 等、李洪连、王金生等（ 1993）用炭疽病（ 抗菌或激发子处理的黄瓜植株产生对致病菌的抗性，同时叶片中酚类物质的沉积作用增强， 在黄瓜叶片提取物中发现糖基化的类黄酮类抗毒素（ 2004）。 病相关蛋白（ 由 1970） 发现的病程相关蛋白 （ R /认为是植物产生诱导抗病性的生化机制之一， 作为 生的标志。 到目前 白包括 17 个蛋白家族。其中 、 丁质酶）、 族的 白在离体条件下显示抗微生物活性的 白中，研究的最广泛的是 丁 质酶）和 （ ,1996； R,1996；， 1988； ， 1993）。 酸性 要分布于植物细胞间隙，碱性 多分布于细胞液中， 分子量都很低。 现的活性主要有几丁质酶、 3功能主要包括 :攻击病原物、降解细胞壁大分子释放二级 (内源 )激发子、分解毒素、结合或抑制病毒外壳蛋白等。 在黄瓜叶片上用真菌、细菌、病毒侵染后，可诱导 累 （ ， 1980； F 等， 1995； ， 1982； ， 1994)。关于这方面的诱导抗病机制还需要更为深入地研究。 病信号物质 目前，黄瓜系统抗病性已成为研究热点，诱导抗病的信号路径是系统抗病性研究的重要内容，诱导抗病性的一些信号物质相继被报道。植物激素 杨酸（ 茉莉酸（ 乙烯被公认系统信号分子。在诱导抗病的过程中，诱导因子、病原菌和植物的互作是一个复杂过程。当诱导因子作用植物时，诱导抗病路径被激活，信号因子开始转移、扩散，防 御基因的转录活化，抗病相关物质表达，形成化学的或物理的屏障。 1995）利用 导黄瓜体内的 断诱导菌与黄瓜叶片互作产生原初信号，从而激发 导系统抗性产生。 1984）报道。短暂热击后可诱导黄瓜感病品种对黑星病的抗性，同时热击后 6小时，乙烯积累量比对照株中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 高出大约 2倍。热击黄瓜苗中乙烯含量的增加可能是由于其 前体 11量增加的结果，热击增加了 而使 烟草和拟南芥转基因试验证明， 徐建明 , 2000） 。 李冠， 1988） 。 抗坏血酸过氧化物酶（ 等 最终积累 沈文飚 , 1999)。 瓜诱导抗病性分子机制 在植物 的诱导抗病进程中先后有两套基因起作用，即抗病基因和防卫反应基因。抗病基因产物与病菌无毒基因产物有识别作用，从而诱导防卫反应基因的表达。同时，一些调节抗病相关物质表达的基因也起作用。 （ 1993）提出黄瓜对炭疽病的系统获得抗性（ 作用模式，病原菌诱导合成，从而激活信号转导路径，引起一系列 关基因的协调表达，导致系统抗性蛋白在黄瓜中大量积累。放射标记证明， 被病原菌侵染后的植物中产生的苯丙氨酸和苯甲酸合成的 （ 995） 。 （ 1995）从表达 黄瓜叶片的胞间滤液中提取出一种 33近氧化物酶（ 运用 部分氨基酸序列获得全长为1218克隆（ 从这种 断出的氨基酸序列与经纯化的蛋白质测得的氨基酸序列是一致的，同时也证明 许多已知植物过氧化物酶的典型形式。 指出，利用非致病细菌 诱导黄瓜植物的系统抗病性，该菌的诱导作用是通过细菌内的 因控制的， 因编码的 白起到激发植物抗病性的作用 ( E, 1996)。有研究证实查尔酮合成酶（ 查尔酮合成酶同工酶（ 因的表达活性增强与黄瓜的诱导抗性直接相关，明确了类黄酮化合物在该种植物复杂的防御体系中起到重要的作用 (, 2002)。柴立红等 （ 2003） 针对 种茉莉酸类似物）对黄瓜花叶病毒基因组 制和积累的影响，采用 杂交并结合定量检测方法，确定不同浓度的 理后在不同的时间对病毒 荷量的影响。 黄瓜发芽期经冷处理可以诱导赖氨酸脱羧酶基因表达（逯明辉， 2005）。 诱导抗病性的分子机 制的研究在 拟南芥、番茄和烟草等模式植物上研究的较深入。 黄瓜诱导抗病性的研究展望 诱导抗病性具有无污染、抗菌谱广、持续时间较长、可控性等特点，因此具有良好的应用前景。 田波将卫星 合到病毒基因组 ，研制成功两个生防制剂（ 田间试验表明这些生防制剂能诱导黄瓜对霜霉病的抗性，显著减轻病害发生，增加产量，用卫星 弱，由致弱 控制 卫星 成的生防因子（ 诱导黄瓜植株对霜霉病的抗性（ ,1990； Y,H， 1992）。 （ 1998）研究了三种 : 、 和 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 对黄瓜抗炭疽病 （ 、角斑病 （ 和葫芦萎缩病 （ 的诱导抗病效果。结果表明 ,这三种混合物的诱抗效果达到了一种人工合成的化学诱抗剂 效果 ,并且有显著的促进植物生长的作用。 为了快速、有效地推进黄瓜诱导抗病性研究在实际中的应用，应加强在以下三方面的研究内容：进一步加强黄瓜诱导抗病机制的研究，为其有效地利用提供可靠的理论依据；建立方便、简单、有效的黄瓜诱导剂的筛选体系，如 （ 1998）建立了一种快速的检测生物和非生物 导剂的系统 欧芹悬浮细胞，这种诱导剂筛选体系是否适用于黄瓜上还有待进一步验证；对诱导剂进行风险评估，特别是化学合成诱导剂对作物生长发育、产量及环境的影响； （ 3） 在应用性的研究方面，进行 诱导剂田间应用的条件的研究。 许多学者正在致力于黄瓜诱导抗病性机制的研究，这必将 为诱导抗病技术最终应用于生产实践，取代目前化学药剂防治病害的方法奠定理论基础。 1.3 术在研究植物基因差异表达中的应用 析技术是由 发明并由 1995）发展起来的一种检测 态性的新方法。由于结合了 技术优势， 具了稳定性强和灵敏度高的特点，同时也因为它丰富的多态信息量（ 易操作性，是近几年发展最快的 子标记技术。 术的应用 因表达特性的研究 析同其它 纹技术和基于 片技术比较，可直接地研究基因表达特性 (et 1999). (1996)利用己知表达模式的土豆贮藏蛋白 因验证 术研究基因表达的可行性，证实它可用于研究基因的 时空表达模式。 将 于研究植物与病原间相互作用的关系，并且试图阐明相互作用过程中基因表达的变化 (et 2000a;2000b)。 传标记分析 (2000)利用 析木薯作图群体的一对亲本，获得 500 多个它们分别在各自的亲本中表达，对其中 50 个 行克隆和分析，并将部分标记定位于遗传图谱上。同时，对 传作图表明， 随机 更多的多态性。另外， 可以用于遗传群体分析，直接构建基因组范围的转录图谱， 到的差异克隆可直接作为一个遗传标记用于遗传分析中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 (， 2002)。 离特异表达的基因 分析基因表达差异，寻找分子标记最终的目的是为了分离基因以及研究该基因对于生物个体发育的影响。研究发现利用单酶切 术，比较普通牵牛白花、红花两个品系的花芽 得 2 个在两个品种有不同扩增条带的 段（ ，1997）。 (2000)利用 法分离了不同环境条件下，植物病原基因表达不同序列，并通过 交分析证明。进一步研究指出 比较在分离差异表达基因方面具有更高的可行性（ 1998 ）。利用传统的 法，依赖于 与随机引物间的 增， 3端的非编码区也常被扩增，所以差异表达的序列包含的信息少，利用该片段所获得的序列信息来分离基因非常困 难。相反 得我们最大可能地获得编码区的信息（李子银， 1999；凌杏元， 2000）。 本研究的意义 黄瓜黑星病是一种重要的流行性病害，广泛分布于欧洲、北美洲和东南亚一带，在我国的东北、华北等省市都有发生 ,特别在东北三省是保护地黄瓜生产上的重要病害之一。 黄瓜黑星病的病原为瓜枝孢 (半枝菌亚门枝孢属，菌丝白色至灰色，具分隔，分生孢子梗细长，丛生，褐色或淡褐色，顶部、中部有分枝或单枝，分生孢子圆柱形，近梭形，单生或串生，褐色或橄榄绿 色，光滑或具微刺。黄瓜整个生育期均可发生此病，其中以幼嫩部分易感病。 病原菌对寄主的破坏是通过各致病因子对寄主超微结构的影响来实现的。关于瓜枝孢菌侵染后寄主的病理变化前人已有一些研究 , 并推测纤维素酶在分解细胞壁中可能起重要作用。细胞壁降解酶和毒素是瓜枝孢菌在侵染黄瓜过程中重要的致病因子（ 李宝聚， 1999； 2000； 2001） ，这对瓜枝孢菌致病机理的认识具有重要的理论意义。 本课题组利用物理方法诱变筛选到几个具有弱致病性的瓜枝孢 弱致病 菌株，并已经证明瓜枝孢 弱致病 菌株具有致弱稳定性和对黄瓜具有较好的诱导抗病 性，这种诱导抗病性作用也具有高稳定性（ 关爱民， 2005） ，本文将在此研究的基础上，利用 术，在表达水平上分析瓜枝孢 弱致病 菌株诱导黄瓜产生抗病性的时序表达进程，初步探讨瓜枝孢 弱致病 菌株诱导黄瓜抗性的分子机制以及利用 术对瓜枝孢 弱致病 菌株进行了基因组分析，为获得瓜枝 弱致病 菌株诱导黄瓜抗性的相关全长 而克隆相关基因以及深入探讨其分子机制奠定基础。 目前，蔬菜的种植条件有利于病害的发生与流行，一旦发病往往造成重大经济损失。并且当前蔬菜病害的防治技术水平低，手段单一，满足 不了生产发展的需要，而使用化学农药防治污染严重，且易导致病菌产生抗药性。而抗性品种的育种手段繁杂，年限较长，抗性中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 品种的农艺性状有待改良等。因此，生物防治已成为现今病害防治研究的热点。用 弱致病 菌株诱导寄主植物产生对强菌侵