【毕业学位论文】（Word原稿）苏云金芽胞杆菌G03的芽胞形成相关基因对cry基因表达的影响生物化学与分子生物学博士论文

密级 :无 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 苏云金芽 胞 杆菌 芽 胞 形成相关基因 对 因表达的影响 of on of 03 F of on of 03 摘 要 苏云金芽 胞 杆菌（ 称 其杀虫效果 好、 安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物 。 其它芽 胞 杆菌相比，一个显著特点就是不仅能够形成芽 胞 ，同时还能产生由杀虫蛋白组成的晶体。在模式芽 胞 杆菌枯草杆菌中有关芽 胞 形成的相关基因研究较深入，而 体形成机制方面的研究主要是集中在杀虫 晶体蛋白基因的表达调控，有关晶体形成与芽 胞 形成相关基因关系的研究报道极少。 本 研究利用 苏云金芽 胞 杆菌全基因 组 序列 ， 初步研究 了 芽 胞 形成 相关基因与杀虫蛋白基因表达、调控的相互关系 。 利用携带 座子 的 建了 B. 03 的转座子突变体库，获得了50,000 株具有 壮观 霉素抗性的突变体 。 筛选 获得 一 株不能产生 芽 胞 和晶体的突变株 ， 命名为:分析 座子 两端 的侧翼序列 确定了插入位点位于 端，并造成了 9 个碱基的重复。 析 表明， 座子 在染色体上只有一个插入位点。 析表明 晶体蛋白 的表达由于 因的失活而受到严重影响。 已知编码晶体蛋白的 因是 子共同控制转录的，而且 子发挥主要作用，据此 推测 子的活性有可能因 因的失活而降低。枯草芽 胞 杆菌作为芽 胞 杆菌的模式菌，其芽 胞 形成 的 级联调控网络中， 因的转录是由上游的 ， 白则是激活下游的 子所必需的，过去未见 白影响子活性的报道。为进一步分析 胞 与晶体形成 相关基因调控的相互作用与特点，我们又开展了下面的研究。 构建了 因的敲除载体 后导入 株，通过高温 诱导突变获得了因 的缺失突变株 )。该突变 株 不能产生芽胞 和 晶体 ， 析表明 只能产生少量的杀虫蛋白 。 克隆 了 因 的启动子，并构建了 携带 -/表 达 载 体 然 后 将 载 体 别 导 入 出 发 菌 株 突 变 株:)中，转录分析表明 两 突变株中 的 因 活性严重降低 。克隆 株中由 接调控的 因的启动子，构建了携带 -/ 达 载 体 将 载 体 别 导 入 出 发 菌 株 突 变 株:)中， 转录分析 表明 因的 活性显著降低，说明 因的敲除严重降低了 子的活性。以上结果说明 因的失活导致株不产生杀虫晶体，是由于 因为 子维持高活性所必需 。 在芽 胞 形成中因对 子存在一种反向正调节作用，它的缺失导致 子活性降低，从而导致 因的活性降低。 为证实 因 的下游基因缺失是否影响 子活性，我们对直接参与 子激活的 纵子进行了以下 研究。 构建 了 纵子 的敲除载体 敲 除 得了突变株 ） 。该突变 株 也丧失了产生芽胞和晶体的能力， 变株 ） 的杀虫蛋白产量也非常低 。 为了验证 纵子的功能，构建了恢复载体 行了 功能互补实验 。 结果表明 部分恢复了 突变 株 ） 产 生 芽 胞 和形成晶体 的 能力 。 将载体 别导入突变株 ） ，转录分析表明 因的 活性 显著降低，说明 纵子缺失也可导致 子的活性降低，进而影响 因的表达。杀虫蛋白表达量的 析发现， 与 纵子对 子的活性影响要小一些。 关键词： 苏云金芽 胞 杆菌， 芽胞， 杀虫晶体蛋白 ， 因 ， 纵子 ，表达调控 is as Bt of as a of of is is on of is We of We a B. 03 of 03 (:is in of on NA by to of of is by in a So of of In of of is by is at of is of is at of no of In to of 03 03() a of t of of 03() 03(:of by of 03() 03(:of of In a of of to of is to of of of in of of In to of of on of we of in of 03 03() of of At is to of of 03() of So of to of in of of on of of 国农业科学院博士学位论文 目录 i 目录 绪 论 . 1 1 虫晶体蛋白 . 1 t 杀虫晶体蛋白基因 . 1 虫晶体蛋白基因的表达调控 . 2 2 芽胞 . 3 胞形 成的起始 . 4 胞不对称分裂和前芽胞的形成 . 5 因的区室化表达和芽胞内吞 . 5 胞的成熟 . 8 胞的萌发 . 8 究前景 . 9 3 芽胞杆菌功能基因组学的研究方法 . 10 式基因组 . 10 因表达 . 11 座子插入突变 . 13 源重组敲除技术 . 15 物信息学 . 16 4 本研究的立题依据 . 19 5 本研究 的目的和意义 . 19 第一章 转座子突变体库的构建和筛选 . 20 1 材料与方法 . 20 验材料 . 20 究方法 . 22 2 结果与分析 . 25 03 菌株突变体库的构建与鉴定 . 25 变株芽胞和晶体的观察 . 27 变株 因型的鉴定 . 27 3 讨论 . 28 座子及突变技术 . 28 芽胞和无晶体突变株的筛选 . 29 4 小结 . 29 第二章 突变株 :研究 . 30 1 材料和方法 . 30 验材料 . 30 究方法 . 31 2 结果与分析 . 35 座子在突变株染色体 的拷贝数分析 . 35 中国农业科学院博士学位论文 目录 组质 粒 鉴定 . 35 座子侧翼序列分析 . 36 2.4 因的序列分析 . 37 白的生物信息学分析 . 38 白在 的同源性比较与系统进化分析 . 41 变株形成芽胞和晶体能力的检测 . 43 变株杀虫晶体蛋白的分析 . 44 3 讨论 . 44 变位点的确定和目的基因的克隆 . 44 白的特点和可能的生物学功能 . 45 4 小结 . 45 第三章 敲除 因 影响杀虫蛋白表达的机制初探 . 46 1 材料与方法 . 46 验材料 . 46 究方法 . 47 2 结果与分析 . 54 除载体 构建与鉴定 . 54 变株的获得 . 56 变株的生长特性 . 56 变株产生芽胞和晶体能力的检测 . 57 变株产杀虫蛋白能力的分析 . 57 2.6 因失活影响 因转录的分析 . 58 变株中 子的活性分析 . 59 2.8 因突变株 杀虫能力的生物测定 . 62 3 讨论 . 62 因敲除技术 . 62 因互作的研究 . 62 白在调控中可能扮演的角色 . 63 4 小结 . 63 第四章 纵子缺失对芽胞形成和杀虫蛋白表达的影响 . 64 1 材料和方法 . 64 验材料 . 64 究方法 . 65 2 结果与分析 . 68 2.1 纵子的克隆与序列分析 . 68 除载体 构建与鉴定 . 71 变株的获得 . 72 变株产生芽胞和晶体能力的检测 . 72 变株 )的功能恢复 . 73 变株产杀虫蛋白能力的分析 . 74 中国农业科学院博士学位论文 目录 变株 ） 中 因转录的分析 . 74 t 中部分依赖于 录的启动子序列分析 . 76 变株 ） 杀虫能力的生物测定 . 76 因与 纵子影响杀虫蛋白表达的比较 . 76 3 讨论 . 77 3.1 子下游基因对其活 性的影响 . 77 云金芽胞杆菌中的 节子 . 78 4 小结 . 78 第五章 结 论 . 79 参考文献 . 80 致 谢 . 93 作者简历 . 94 中国农业科学院博士学位论文 插图和附表 图和附表 绪 论 表 1 数据库列表 17 图 1 苏云金芽胞杆菌中的芽胞和晶 体 1 图 2 芽胞形成过程示意 图 4 图 3 s i g 子对芽胞和杀虫蛋白形成的调控示意图 9 图 4 座子的结构 14 图 5 双交换原理 示意图 16 第一章 表 1株和质粒 20 图 1变程序示意 图 24 图 1变体库的抗性检验 26 图 1变体的 定结果 26 图 1发菌株 芽胞和晶体 （ 1627 图 1变株的芽胞和晶体（ 1627 图 1变株 因型的鉴定 28 第二章 表 2株和质粒 30 图 2变株 析 35 图 2粒 酶切 分析 36 图 2粒 定 36 图 2 座子的侧翼序列 36 图 203 白的二级结构预测图 39 图 2测的不同菌株 白的二级结构比较 结果 39 图 2t 白跨膜区的预测分