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内含肽及其应用姓名：刘郁倩 学号：1043095030 专业：轻工生物技术摘要：尽管内含肽对生物体内及蛋白质宿主本身的生物学功能目前所知甚少,但从其被发现至今短短的二十几年内, 无论是在基础科学研究中还是在医学实践已经得到了广泛关注和应用。本文阐述了内含肽的定义、发现、分布、结构、核酸内切酶活性、剪接机制。介绍了内含肽的应用方式。并对内含肽的应用前景进行了展望。关键词：内含肽；核酸内切酶活性；剪接机制；应用1内含肽的基本概念1.1内含肽的定义内含肽，即蛋白质内含子，是存在于前体蛋白质中的一段氨基酸序列，在前体蛋白转变为成熟蛋白的过程中，它靠自我剪切的方式从前体蛋白中释放出来，同时两端的肽链以肽键的方式相连，该过程即为蛋白质剪接。蛋白质剪接不同于RNA剪接，前者的剪接发生在蛋白质水平，而后者的剪接发生在RNA水平；它也不同于蛋白质翻译后加工，后者往往只是切除前体蛋白N端或C端的一些片段，通常没有多肽链的形成；而且也不同于酶原活化，蛋白质剪接有新肽键的形成。与内含肽相对应的是蛋白质外显肽，即内含肽两侧的氨基酸序列。位于内含肽N端的序列称为N-外显肽，位于内含肽C端的序列称为C-外显肽。N-、C-外显肽在内含肽的作用下通过肽键连接成完整的成熟蛋白。内含肽有8种存在状态：剪接反应前称为融合内含肽，剪接反应后称为游离内含肽。两者的一级结构相同但功能却不同，前者可以自催化蛋白质前体的剪接反应，后者可作为归巢核酸内切酶参与内含肽归巢1。1.2内含肽的发现1990年Kane等在研究酵母液泡H+-ATPase的69kD(1D=1u=1.660540210-27kg)亚基基因vma1时首次发现蛋白质自我剪接现象。此后两个研究组又分别在海滨嗜热球菌的DNA聚合酶基因以及结核分支杆菌的recA基因中发现了类似情形。随后又陆续在多种生物中发现了蛋白质内含肽。截止2002年7月,共有136种蛋白质内含肽注册在http:PPPnebPinteins.html.这些内含肽主要来源于古细菌、真细菌和真核细胞。其中真核细胞7种，真细菌中47种，古细菌中82种2。同时还发现蛋白质内含肽具有两种不同的酶活性，除了能够进行蛋白质自我剪接外，还可以介导DNA片段的转移，即具有归巢核酸内切酶活性。Guhan3等人最近的研究发现，结核分支杆菌的RecA内含肽含有一个新的ATP依赖的位点特异的双链DNA核酸内切酶活性。结核分支杆菌recA基因的开放阅读框架有一段插入序列，猜测可能编码核酸内切酶(PI2MtuI)，recA基因归巢到没有recA序列等位基因处必须要求这种内切酶活性。PI2MtuI结合双链和单链DNA的能力相同，但只有在辅助因子的作用下才能切开DNA链。 值得注意的是，在有交替辅助因子作用下，PI2MtuI能够使超螺旋DNA出现缺口，但需要Mn2+和ATP产生线性双链DNA。这一结果表明RecA内含肽是一新的Mn2+-ATP依赖的双链位点特异核酸内切酶，它可能在归巢过程中起重要作用4。1.3内含肽的分布内含肽的分布广泛，生物三大系统中都存在内含肽，且在真核生物的细胞器和细胞核中都有分布。但同源比较发现真核生物的内含肽只存在于单细胞真核生物中，而在多细胞真核生物中未见报道。在182个内含肽中，古细菌占86个，真细菌76个，其余20个在真核生物中。可以明显地看出，内含肽在古细菌中比较丰富，真细菌次之，真核生物中最少，这一分布规律与RNA内含子相反，这在一定程度上说明了内含肽的分布在种属上有一定差异。另外，50%以上的内含肽是分布在与DNA复制、修复、转录和翻译有关的酶或蛋白质中，少数在谷胺酰果糖-6-磷酸转氨酶和液泡三磷酸腺苷酶等代谢酶中，这说明内含肽分布在蛋白质种类间有一定差异。1.4内含肽的结构大部分内含肽由两端的剪切区域和中间的核酸内切酶结构域或连接结构域组成。根据这一特征, 内含肽可分为3种: 经典内含肽、微小内含肽和断裂型内含肽。经典内含肽和微小内含肽均包含两端的剪接结构域和中间区域, 不同的是, 前者中间区域为核酸内切酶结构域, 而后者为连接结构域, 不同微小内含肽连接结构域的长度并不相同。断裂型内含肽的中间区域在特定位点断开, 形成N端片段(IN)和C端片段(IC), 而且分别位于基因组上相距较远的2个基因上, 在前体蛋白翻译成熟过程中, 这2个片段相互识别并恢复核酸内切酶活性, 介导蛋白质反式剪切。序列分析表明, 内含肽由 10 个模块组成。从内含肽N端开始依次为A、N2、B、N4、C、D、E、H、F 和G, 其中A、N2 、B、N4为N端剪切区域, F、G为C端剪接区域, C、D、E、H为自导引核酸内切酶活性区域或连接结构域。Perler等对内含肽序列的进一步分析表明, 参与内含肽剪接的基序A、B、F、G在剪接位点处的氨基酸残基高度保守, 并参加了内含肽剪接过程中的亲和置换反应。大多数内含肽基序A中含有带有羟基或巯基的氨基酸, 如Ser、CysH。基序B中则含Thr-XX-His高度保守的氨基酸序列, 该序列也存在于丝氨酸蛋白酶中。基序G中参与剪接反应的保守氨基酸残基为Asn、Ser、CysH、Thr、His。比对现有的内含肽序列后发现基序A中的保守位点(如Ser、CysH)在某些内含肽中会被Ala、Gln 或Pro 等所替代, 基序G中也一样5。2 内含肽的核酸内切酶活性蛋白质内含肽这段插入序列，能够转移到没有这一序列的同源蛋白的等位基因上，即内含肽“归巢”，这是内含肽所特有的自导引核酸内切酶活性。自导引核酸内切酶可以识别、切割不含内含肽编码序列的同源蛋白质的等位基因，在重组酶、DNA聚合酶、连接酶、分解酶的作用下，利用同源重组，将编码内含肽的基因拷贝转移到不含内含肽的等位基因上，且插入位点两端不形成重复序列。这种编码内含肽的DNA具有可移动性，是一种不同于转座子的可移动的遗传因子。归巢核酸内切酶可分为4个家族，分别含有1-2个LAGLI-DADG模体，1个GIY-YIG模体，1个His-Cys模体，1个H-N-H模体。大部分内含肽含有2个LAGLI-DADG模体。自导引核酸内切酶在DNA识别区域跨越12-40个碱基对，相对于限制性核酸内切酶而言，自导引核酸内切酶更能忍受在识别区域的碱基对的变化。自导引核酸内切酶在古细菌、真细菌、真核生物中都有分布，而限制性核酸内切酶只分布于古细菌、真细菌、某些真核生物中。另外，自导引核酸内切酶不象其他的核酸内切酶需要其他分子的辅助才能发挥作用。不过，近来发现了一些归巢核酸内切酶作用也需要金属离子，Ku等发现在ColE7核酸内切酶的HNH家族中，Zn2+在稳定酶结构和水解DNA过程中是必需的。Guhan等的研究也表明结核分支杆菌的RecA内含肽是Mn3+依赖性的。3 内含肽的剪接机制1993年，对内含肽的研究取得了突破性进展，美国新英格兰生物学实验室的科学家们构建了体外剪接系统6。该系统能对有活性的蛋白质前体进行纯化，研究发现，纯化的蛋白质前体在没有其他蛋白质或者辅助因子存在的情况下，可以进行自我剪接反应，这为内含肽的剪接是发生在蛋白质水平上提供了直接的证据。体外剪接体系的发展大大地促进了对内含肽剪接机制的了解6。蛋白质的剪接可使外显肽之间形成天然的肽键。总的来说，蛋白质剪接大致包括4个步骤。第一步：内含肽的氨基端剪接区通过N-O或者是N-S转移发生重排,氨基端的外显肽结合到氨基端剪接区的丝氨酸（苏氨酸）氧原子或半胱氨酸硫原子上，形成酯键或硫酯键中间产物。第二步：羧基端剪接区的亲核残基攻击氨基端剪接区酯键，进行转酯反应，氨基端的外显肽结合到羧基端剪接区的丝氨酸（苏氨酸）氧原子或半胱氨酸硫原子上，产生分枝状中间产物。第三步：羧基端剪接区的天冬酰胺环化使内含肽与羧基端外显肽之间发生断裂，内含肽被剪切下来7。第四步：内含肽脱离的同时，通过酯键（或硫酯键）连接的两个外显肽经过重排形成肽键，蛋白质成熟。中断第二步或者第三步反应，内含肽仅仅在N-端外显肽与N-端内含肽之间发生剪切作用，可以使N-端外显肽得到纯化；而中断第一步和第二步反应，内含肽则仅仅在C-端外显肽与C-端内含肽之间发生剪切作用，因此，C-端外显肽能够被纯化。4 内含肽的应用4.1 快速纯化目的蛋白将靶蛋白与内含肽相互融合能实现靶蛋白的一步纯化。最先人们使用SceVMA 内含肽来进行蛋白质纯化, 先用Ala取代内含肽C端的Asp残基, 再连接上几丁质作为C端的外显肽, 而目的蛋白作为N端外显肽。翻译后的蛋白前体进行N端剪接, 目的蛋白游离出来，但C端不能剪切, 导致内含肽仍与几丁质相连, 利用几丁质树脂的吸附作用即可将目的蛋白纯化出来。同样的, 也可以用Glu取代C端His残基来调节内含肽C端的剪接, 实现蛋白质纯化。Srinivasa等5利用此方法实现了对大肠杆菌(E.coli)中表达出的人体巨细胞集落刺激因子。4.2 基因诊断与基因治疗内含肽的插入会导致宿主蛋白的结构和功能发生改变，但经剪接后宿主蛋白能恢复原有的结构和功能。利用这一特点可将内含肽插入重组基因的内部，使细胞质内合成的重组蛋白降低自身的疏水性从而得以透过细胞质到达线粒体内部，再通过内含肽自我剪接使重组蛋白恢复原有的功能和活性，由此达到线粒体基因治疗的目的。将内含肽插入到核酸代谢相关基因的内部能干扰到核酸代谢相关蛋白质的表达，因此内含肽可作为药物靶点，而阻断内含肽自我剪接的物质将成为基因治疗药物。Paulus5利用内含肽成功扰乱与结核分支杆菌DNA修复和复制相关的蛋白RecA和DnaB的合成, 导致结核分支杆菌生长受到抑制, 甚至细胞死亡。4.3 突变体的构建Mycobacterium xenopi内含肽Mxe GyrA表现出温度敏感性，在30条件下可以进行正常的剪接反应，形成功能性的宿主蛋白；而在37条件下，内含肽不能进行自我剪接，导致宿主蛋白不能成熟。Zeidler等8采用低保真性PCR技术构建突变体文库，筛选温度敏感性内含肽。温度敏感性的Sce VMA内含肽的剪接反应，在18条件下可以正常进行，随着温度升高，剪接反应逐渐降低，至30时不再进行反应。在Drosophila melanogaster中，Gal80是Gal4转录因子的负调控子。Zeidler等将温度敏感性Sce VMA内含肽插入到Gal80中，在允许温度条件下，内含肽进行正常剪接，具有功能的Gal80可以形成，导致Gal4被抑制，2半乳糖苷酶不能合成，D. melanogaster不能利用乳糖；而在限制温度条件下，内含肽不能正常剪接，功能性的Gal80不能被形成，Gal4继续保持活性，2半乳糖苷酶可以合成，D. melanogaster能够利用乳糖。温度敏感性的Sce VMA内含肽也可以插入到T7-RNA聚合酶中，同时将目的基因置于T7启动子下，通过改变温度控制T7-RNA聚合酶中内含肽的剪接作用，调节功能性的T7-RNA聚合酶的形成，从而控制目的基因的表达。内含肽的这一作用将有助于功能基因组学的研究。在当前后基因组学时代，基因功能的研究往往需要构建突变体，然后进行互补实验。构建内含肽介导的温度敏感型突变体，通过改变温度条件就可以决定目的基因的表达与否，条件容易控制，便于观察。该技术有利于批量突变体库的构建，在功能基因组学的研究中具有很好的应用前景。4.4 毒素蛋白的合成当前生物技术领域对内含肽反式作用机制的应用更为普遍，因此，分离内含肽被广为应用。由于毒素蛋白对表达宿主存在毒害作用，所以在表达体系中难以获得大量表达产物。将毒素蛋白分裂成两部分可以降低其毒性，甚至使毒性丧失。分裂的毒素蛋白与分离内含肽的两部分分别进行融合、表达和纯化。两种纯化的融合蛋白混合后，在分离内含肽的作用下，重新形成完整的具有活性的毒素蛋白9。分裂的毒素蛋白降低甚至丧失了毒性，因而可以在宿主中得到大量表达；同时，体外拼接形成的完整毒素蛋白又能恢复其天然活性，可以用于功能研究。4.5 介导蛋白质环化和多聚体制备内含肽还可用来制备蛋白质串联多聚体和环肽。将目标基因插入2个内含肽之间, 经转录、翻译、蛋白质剪接后目的蛋白N端留下1个Cys残基，目的蛋白C端留下硫酯键，再通过目的蛋白N端Cys的SH基团进攻C端硫酯键完成环化。内含肽介导的蛋白质环化技术可用于研究蛋白质作用机理，Volkmann等5利用断裂型内含肽构建了环状的弧菌酰基-载体蛋白质，研究了酰基转移中ACP蛋白伸展所需的条件。4.6 介导蛋白质连接内含肽还可以介导蛋白连接或表达蛋白连接。将目的基因连接在内含肽的N端，在还原剂(如巯基试剂)存在时，经过蛋白质剪接后所得的目的蛋白的C端留下1个活泼的硫脂键，该硫酯键可用于连接标记物或探针(如自旋标记或荧光标签)、其他蛋白质和非天然氨基酸(如生物素化或磷酸化的氨基酸)，从而为研究蛋白与蛋白之间的相互作用以及目标蛋白在细胞内的代谢路径提供方便5。4.7 在转基因植物中的应用随着人类生活水平的提高和人口数量的增长,人们对粮食的品质、数量和安全性有了更高的要求。转基因植物的出现部分解决了化学农药残留的问题, 具有良好的应用前景。但由于抗3种除草剂(草甘膦, 固杀草和保幼酮)的超级杂草的出现, 抗药性基因的传播问题再次引起人们对转基因植物安全性的关注。已有多种方法被用来防止基因污染, 其中叶绿体工程和断裂型内含肽的组合引人瞩目。研究人员对葡萄糖醛酸酶基因和抗药性基因如5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因进行了基因工程改造。Chen等10利用合理的接点对目的基因进行接点的文库选择,将靶基因N端和C端片段分别与Ssp DnaE内含肽片段形成融合基因并克隆在大肠杆菌中,这2段靶蛋白内含肽片段表达后能产生抗药性。然后,利用农杆菌转化或基因枪轰击植株,将靶基因N端插入核基因组、靶基因C端插入叶绿体基因组上,分别转录、翻译。核基因组上的靶基因-内含肽产物进入叶绿体内与另一段靶基因-内含肽产物剪接，形成一个完整的有功能的靶蛋白产物。由于叶绿体属于母性遗传，通过花粉并不能够携带完整的外源基因，因此，通过靶基因蛋白的定点表达和功能重构为避免基因污染提供了可能。4.8 在蛋白微阵列中的应用蛋白芯片由于只需要少量分析物和可进行高通量的筛选,已经成为蛋白质组学中一个非常理想的工具。Camarero等利用Ssp DnaE的高效性和特异性,将目的蛋白固定在固体表面进行蛋白筛选, 并且不须纯化或再浓缩的步骤。先将内含肽C端(IC)片段固定在玻璃表面, 把与目的蛋白连接的内含肽N端(IN)片段涂在玻璃板上, 剪接反应发生以后, 内含肽自动切除, 而目的蛋白则被固定在玻璃板上以便进行筛选。4.9 在cDNA文库中的应用真核细胞尤其是哺乳类细胞一个最重要的特点是蛋白的功能和蛋白的定位是紧密联系的, 多肽只有到了特定的细胞器中才行使它的功能。以Ssp DnaE 内含肽和断裂的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为基础, Umezawa等在线粒体中将Ssp DnaE内含肽的IC片段和线粒体目的信号(MTS)、EGFP相连(MTS-IC-EGFP)后定位于线粒体中;将从mRNA反转录得到的cDNA文库同Ssp DnaE内含肽IN片段和EGFP片段相连后连接到反转录病毒表达载体上, 转染哺乳动物细胞, 表达含有IN片段的多肽, 与IC片段融合产生EGFP, 发生荧光反应, 方便筛选目的蛋白。这种方法改进了目前的cDNA文库技术。5 展望尽管内含肽对生物体内及蛋白质宿主本身的生物学功能目前所知甚少,但从其被发现至今短短的二十几年内, 无论是在基础科学研究中还是在医学实践已经得到了广泛关注和应用。随着研究的深入,内含肽将会在更多的生物技术领域和生产实践中发挥重要作用。例如,内含肽介导的蛋白质相互连接,可用于合成多功能的复合酶,应用于发酵工业,不同的酶蛋白被融合在一起,在发酵过程中能够同时进行酶催化反应,不用分批次地分别投入,这样可以减少污染机会；内含肽也可以用于固定化酶技术,使具有降解作用的蛋白质或酶与高度亲和某固定相的成分进行共价结合,形成固定化酶,应用于污染物的生物处理,有利于环境保护,重复利用还可以提高酶的利用率,降低投入量；在内含肽参与下合成的蛋白质-核酸杂合体,能够形成双功能的蛋白质-核酸芯片,进行蛋白质和核酸两个水平上的检测。然而,内含肽在不同生物技术领域的应用,需要周全的考虑,如表达系统的选择、合适内含肽的确定、内含肽中恰当的突变引入、表达系统中合适密码子的使用、目的蛋白中内含肽适宜插入位点的选择、表达条件的确定和优化、内含肽介导的剪切或剪接条件的确定等。一旦内含肽应用到实际生产中,以上问题都必须充分考虑,以保证高效、低成本。如何更好地利用自然界赐予人类的如此美妙的天然自我剪接工具,还有待于生物学家的深入开发。参考文献：1 李素丽,郑斌,詹希美.蛋白质内含肽及其生物学意义J.生物技术通讯，2005,16(5):552-555.2 周力,吴肖群.脂质体及其应用J.现代化工,1997,9:18-20.3 王瓞,林其谁.脂质体药物传递系统J.生命科学,1999,4:155-159.4 郝岗平,杨清.蛋白质内含肽的研究进展J.生命科学研究，2002,6(4):136-139.5 韦静宜,宋洪元,李成琼.蛋白质内含肽的研究及应用进展J.植物生理学通