【毕业学位论文】（Word原稿）微生物来源CpG疫苗佐剂筛选研究特种经济动物饲养学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 微生物来源 苗佐剂筛选研究 pG pG 摘 要 一些具有免疫激活功能的以未甲基化的 包括含 量研究证实， 化因子、粘附因子和共刺激分子等，诱导机体天然免疫系统活化，并产生抗原特异性的获得性免疫应答。 本项研究依据 成和 克隆了 32条 过体外筛选及动物免疫试验选出 4种免疫效果好、安全可靠的序列，为 究内容如下： 从四种非致病性的食品酿造菌（枯草芽孢杆菌、德氏乳酸菌、黄色短杆菌、双歧杆菌）基因组中找出 27条 由北京华大中生科技发展有限公司合成； 在坏 死梭杆菌保护性抗原基因筛选 工作中，克隆了许多基因片段质粒，从 中找出 4条富含 同时，在 检索 节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因中的 现 ， 将克隆的 坏 死梭杆菌基因片段质粒菌株与节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因质粒菌株分别提取质粒， 无菌采取羊、小鼠血液，肝素钠抗凝。用淋巴细胞分离液分离羊、小鼠淋巴细胞。通过淋巴细胞增殖试验筛选出 4种对羊、小鼠淋巴细胞都有较强细胞增殖作用的序列。 将 淋巴细胞增殖试验选出的 果均无毒副作用。 分别用 坏死梭杆菌抗原、重组节瘤拟杆菌纤毛蛋白抗原制备 弗氏完全佐剂疫苗、氢氧化 铝胶佐剂疫苗、 胶佐剂疫苗免疫小鼠， 发现 氧化 铝胶配合制成氏完全佐剂疫苗有几乎同样的免疫效果，明显好于氢氧化 铝胶佐剂疫苗， 质粒酶切回收的 粒免疫佐剂作用无明显差别。 关键词： 疫佐剂， 疫苗 I NA pG NA of in is to to of s we pG to by in is of ou r no in o.,In of it P6 id to by in it pG l(,pG l( by pG co pG l( as pG pG of m ay be in 录 第一章 绪 论 . 1 究目的和意义 . 1 内外研究现状 . 1 构特征 . 2 免疫激活机理 . 4 疫激活的分子机制 . 5 开发应用 . 6 安全性及面临的问题 . 9 究内容和方法 . 9 生物来源的 品的制备 . 10 巴细胞增殖实验 . 10 品的动物安全性试 验 . 10 苗佐剂实验 . 10 第二章 研究内容 . 11 验材料和方法 . 11 料 . 11 法 . 15 验结果 . 18 列质粒提取，以及 列片段的回收： . 18 巴细胞增殖反应 . 19 全性试验 . 21 疫试验 . 22 论 . 26 第三章 结 论 . 28 参考文献 . 29 致 谢 . 33 者简历 . 34 中国农业科学院硕士学位论文 0 英文缩写 英文全称 中文名称 寡聚脱 氧核苷酸 序 m 分支结核杆菌 病原相关分子模式 模式识别受体 r 白样受体 a B K 基因结合核因子 ac 1 转录因子激活蛋白 1 o sp 活性氧元素 al 白氨基端激酶激酶 I al 白氨基端激酶激酶 1/2 8 髓样分化标志物 r 关激酶 r 6 肿瘤坏死因子相关受体因子 6 K 基因结合核因子抑制因子 r co mp 组织相容性复合体 r co mp 组织相容性复合体 g 免疫球蛋白 肿瘤坏死因子 IL 白细胞介素 o f 分化群 an o f h 辅助性 /诱导性 T 细胞抗原标志 Th 辅助性 T 细胞 B 细胞（抗原识别）受体 细胞毒性 T 细胞 DC 突状细胞 NK 自然杀伤细胞 抑制性 T 淋巴细胞 /细胞毒性 T 淋巴细胞 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 1 第一章 绪 论 究目的和意义 特异性免疫是含有 反应物与天然免疫细胞上的 结合，激活天然免疫应答，从而活化抗感染途径，并最终激活获得性免疫系统的过程 34。高度纯化的新型疫苗因缺少 分，不能被天然免疫细胞的 好识别，不足以产生引起免疫 应答的有效信号。 为佐剂可以克服新型疫苗 足的缺陷，通过模拟感染过程诱导强烈的免疫应答 15。如 苗，在 苗中由于携带抗原编码基因的载体 源于细菌，富含 列，从而保证了 本项研究 为筛选适合坏死梭杆菌抗原及重组节瘤拟杆菌纤毛蛋白的 通过淋巴细胞增殖试验筛选出对羊、小鼠淋巴细胞都有较强细胞增殖作用的序列， 分别用 坏死梭杆菌抗原、重组节瘤拟杆菌纤毛 蛋白抗原制备 弗氏完全佐剂疫苗、氢氧化 铝胶佐剂疫苗、 剂疫苗、 胶佐剂疫苗免疫小鼠，观察 含 列的质粒单独作为佐剂，以及 与氢氧化铝胶配合制成的 胶佐剂的效果，为 剂的研制与应用提供理论依据，为 坏死梭杆菌及重组节瘤拟杆菌纤毛蛋白疫苗佐剂的研制奠定基础 内外研究现状 一些具有免疫激活功能的以未甲基化的 序为核心的 列，它包括含 序的人工合成的寡聚脱氧核苷酸 (自然界中细菌、病毒、无脊椎动物等低等生物的基因组 序 (指一类以非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核糖核苷酸 ,其碱基排列大多遵循以下规律 : 5端为 2 个嘌呤 ,3端为 2 个嘧啶 。 研究表明 ,这种序列可激活多种免疫效应细胞 ,因此又被称为免疫刺激 列。 长期以来， 以引起机体强烈的免疫反应。虽然早在 1965年 41就发现用寡聚脱氧核苷酸与绵羊红细胞一起注射小鼠，可明显提高小鼠对绵羊红细胞的免 疫应答水平，并首先提出寡聚脱氧核苷酸具有免疫佐剂的观点。但是， 0年后的 80年中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 2 代中期 ， 人们经过 研究表明 特别是具有特定序列的细菌 类 具有重要的免疫调节作用。 1984年， 63报道了牛分支结核杆菌 ( 取物中的 有抗肿瘤效应。 在对 究中发现， 脊椎动物 菌 显的差异， 脊椎动物中 苷酸 出现的频率较小约为 1/501/60，其中 70嘧啶 被 甲基化 ；而在 细菌 苷酸 出现的频率为 1/16，约为脊椎动物的 4倍， 其中 仅 5%胞嘧啶 被 甲基化 ， 脊椎动物 4。 脊椎动物 基化是 脊椎动物 由甲基转移酶将胞嘧啶（ C）变为 5啶（ 5一种反应 35。 它 是一种基因外修饰，不改变 在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用 23。 椎动物免疫系统正是通过对未甲基化 识别来辨别细菌 对其产生免疫应答的 56。1种细菌、病毒、无脊椎动物的 67。随 着对 人们对 在 毒免疫、抗肿瘤、抗寄生虫病等方面进行了广泛研究。 构特征 核心结构 鸟嘌呤核苷酸 ( 位碳原子是否被甲基化，如果胞嘧啶发生甲基化，则其活性丧失。 位碳原子甲基化后，可直接影响到其邻近的 也可能是导致 因之一 2。同时， 57发现， 且这两个核苷酸的种类和序列也不能随意改变。实验表明破坏或将 免疫刺激活性也随即消失。 侧翼序列 研究人员将哺乳动物来源的 苷酸 去甲基化处理后免疫物，结果没有产生免疫。 5 嘧啶 并且当 5 端为 3端为中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 3 53通过研究发现 端是细胞内受体识别位点， 5端形成“发卡”或二聚体结构时，则会阻碍受体的识别和结合，使信号传导通路受阻。 骨架长度 纯 6个脱氧核苷酸 生免疫刺激活性的序列为包含上述 0个核苷酸残基 2。 0个碱基，但随后的研究认为含有 15个碱基的 61，可见要产生有效的免疫应答， 5个碱基。 回文结构 对这些 非所有的 有那些含有一个或多个回文序列的 为 且这种回文结构出现的频率越高 ，则免疫刺激性越强。但 64新近研究认为 非回文结构同样具有免疫刺激作用。 骨架结构 硫代磷酸酯、硫代磷酸甲酯等物质修饰后的含 点、抗核酸酶降解能力、细胞对 且免疫活性显著增强。这可能是因为磷酸戊糖骨架结构修饰后，增强了 长了 补了 其更好的发挥免疫刺激作用 65 66。 种属特异性及其它 54通过研究发现低等和高等脊椎动物免疫识别系统对 些对小鼠 细胞则无刺激活性。 有较强的刺激小鼠 对人的 5 人具有最佳的刺激活性，但对小鼠免疫细胞的刺激能力显著降低。可见， 同的 外， 现其在结构上可分为两部分：转录单位（编码区），直接指导合成抗原；佐剂单位（非编码区），辅助机体产生免疫应答，而只有位于非编码区的 于编码区的 22。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 4 免疫激活机理 美国免疫学家 0提出了模式识别理论，将天然免疫针对主要靶分子信号称作病原相关分子模式 （ 相对应的识别受体称为模式识别受体 （ 。 酵母细胞壁上的甘露糖以及脂多糖、多肽糖、胞壁酸等各种细菌的细胞壁成分等，它们在进化中趋于保守。 组与天然免疫密切相关的受体家族， 发的信号传导能导致炎症介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用 36，并最终激活获得性免疫系统。因此有人认为 1。 是对病原体生存极为根 本的结构，因而极为保守， 它 是很多微生物共有的一种保守分子模式， 能够 被天然免疫中 0类受体 。 依据 模式识别理论 ， 可以作为模拟感染的“危险信号”，被宿主天然免疫细胞上的 要为 ， 15。 免疫细胞摄入细菌 泡进一步与内体融合，形成内吞小体，在内吞小体酸化成熟过程中， 同被内吞的 49。有 关研究证实 （ 应激激酶途径，这两条途径可直接激活 和 导特定基因的表达 49。 随着内体的形成，酸性逐渐增强， 而引发细胞内活性氧元素（ 量迅速增加。 从而激发细胞内的应激激酶途径 48。首先，诱导 （ ）磷酸化激活，激活的 白氨基端激酶 1/2（ ）和 和 1（ 这一步也是通过磷酸化 完成的 29。活化的 控如细胞因子、黏附因子、免疫相关分子的基因表达。 途径是指 募衔接蛋白 8（ 酸化，磷酸化的 （ 互作用，激活 激酶复合体，使 直接被磷酸化 25。 是 的特异性抑制因子，通常与 结合使其处于失活状态， 磷酸化后即与 分离，游离的 迁移到细胞核中，激活机体免疫细胞，诱导某些细胞因子基因的表达 16。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 5 疫激活的分子机制 大量研究证实， 括 核 /巨噬细胞、自然杀伤细胞（ 树突状细胞，同时刺激免疫活性细胞分泌多种细胞因子并能上调某些表面分子、趋化因子 、粘附因子和共刺激分子等，诱导机体天然免疫系统活化，并产生抗原特异性的获得性免疫应答。 对 免疫效应 研究发现， 细胞有丝分裂原，可以使 95%的 很短的时间内，就进入了细胞分裂周期的 条件适宜时完成有丝分裂 37。有研究表明， 调节 殖和分化过程中起重要作用，抗 细胞 增生、 接诱导 泌 38。说明细胞 自分泌 特殊循环实现 24。 由 细胞 的活化是 过在 面提供共刺激信号，与 面的 而活化 释放 g55 68。同时， 细胞表面分子的表达，使 胞间粘附因子 亲和力 达下调 51。 通过这些细胞表面分子表达的调整，从而增强机体细胞免疫和体液免疫的协同作用，上调抗原递呈细胞呈递抗原的能力，诱导混合淋巴细胞培养反应和调理吞噬作用 24。 细胞抗原受体（ 激活信号有很强的协同作用，这种协同作用理论上可以促进对抗原的免疫应答的产生 23。 细胞增殖和免疫球蛋白的产生，阻断 细胞的细胞凋亡 25。 对 是在细胞免疫中都发挥重要作用。目前的研究尚未发现 细胞的证据。 细胞。这些因子可刺激 导免疫应答向 生较强的特异性细胞免疫和体液免疫 45。 等通过实验证实 细胞促进使其分泌 可刺激 细胞（ 分泌高水平的 表达抗原特异性细胞毒活性 40。抗原递呈细胞产生高水平的协同刺激活化信号如 6、 12、 18，以及树突状细胞膜表面协同刺激信号分子的表达水平，在 24。 对树突状细胞的免疫效应 树突状细胞（ 机体最主要的抗原递呈细胞，在细胞免疫中起着关键且不可替代的作用，是启动体内 第一章绪论 6 胞。 熟、活化、运动中起着重要的调控作用，它直接激活25。 等报道， 导其分化成熟并产生肿瘤坏死因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、 时拮抗 62发现， 分子以及 时，诱导 8。 对 成防御病原微生物侵袭的第一道防线，是一类不需特异性抗体参与，不受 可杀伤靶细胞的淋巴细胞 24。 过刺激巨噬细胞分泌 强 激产生的25。 对单核 /巨噬细胞的免疫效应 激巨噬细胞产生多种细胞因子如 单核细胞受细菌 强 抗原及 1。 机体的非特异性免疫应答中发挥巨大作用 25。 开发应用 疫佐剂的应用 免疫佐剂广义上是指免疫系统的调节剂，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，能增强该抗原的免疫原性或改变免疫反应类型而本身并无抗原性的物质 7。在疫苗中应用佐剂不仅可以增强疫苗的免疫原性，而且在决定免疫应答产生的类型方面也发挥重要作用。 抗原特异性 助 据其分泌及效应功能的不同，分 为 42。 生 疫苗开发中其目的主要是诱导抗原特异性免疫应答向 11。 自从 20世纪 2种物质被尝试作为佐剂而使疫苗更有效。迄今为止，只有氢氧化铝胶佐剂被 它有一定的缺陷：它不能诱导产生 扰细胞 免疫，阻断 得疫苗的免疫保护不全面、不持久。同时，也存在一定的副作用：如有轻度局部反应，可中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 7 以形成肉芽肿，极个别的发生局部无菌性脓肿。另外，有可能对人、畜神经系统有影响等 18。因此研制新型的可诱导 全、有效、无毒副作用的佐剂成了众多学者研究的热点。 、 突状细胞、巨噬细胞、 分泌以 而诱导 机体特异性细胞与体液免疫反应同时增强，尤 其对细胞免疫应答具有更突出的增强作用。另外， 作用于相同或不同类型的免疫细胞从而组成复杂的免疫网络，通过免疫网络进行免疫调节作用。 可用于灭活疫苗，也可用于活疫苗，而且与其他佐剂有强烈的协同作用，可增强一些弱抗原的免疫原性。 且在于其他佐剂合用时还可弥补其他佐剂诱导 外，一些不能与氢氧化铝胶佐剂混合的减毒活疫苗或多价疫苗， 粘膜免疫佐剂 粘膜免疫系统是一个完整的淋巴细胞网络。一般情况下，经非胃肠道途径传递的抗原只诱导系统性免疫应答，而粘膜免疫接种的抗原则既能诱导局部免疫，又可诱导系统性免疫应答。大多数免疫原性弱的抗原经粘膜供给时，易引起免疫耐受。研究发现， 且可以经鼻腔、口服、直肠等途径接种，具有粘膜佐剂的效应 11。 择性清除 制性 而解除粘膜免疫系统对抗原的免疫耐受性 15。 新型疫苗的佐剂 特异性免疫是含有 活天然免疫应答，从而活化抗感染途径，并最终激活获得性免疫系统的过程 34。高度纯化的新型疫苗因缺少 能被天然免疫细胞的 足以产生引起免疫应答的有效信号。 过模拟感染过程诱导强烈的免疫应答 15。如 含 而保证了 表达量就能激发机体产生强烈的免疫应答。 种疾病的治疗方面 抗肿瘤治疗 动物实验表明：患有 射抗肿瘤单克隆抗体，长期存活率达 70 时 第一章绪论 8 的成熟 和明显促进抗体依赖性细胞毒性细胞作用 ， 联合使用 明显且副作用少 25。 防治过敏性疾病 答的平衡是机体免疫状态正常的必要条件之一。过敏性疾病是由于 引起，与细胞因子 6。若能抑制 且可以使已经发生的 在寄生虫方面的应用 作为免疫治疗药物治疗和预防利什曼原 虫病。 包含 导了利什曼原虫的在利什曼原虫攻击时产生了 40的保护率。 44报道，在用曼氏血吸虫虫卵诱导的鼠肺肉芽肿模型的研究中， 芽肿变小、肉芽肿嗜酸性细胞浸润减少、且， 47报道，在无抗原存在的情况下用恶性疟原虫子孢子攻击小鼠 1 2 果产生了保护作用。在灵长类动物试验中，利用 激产生了较高滴度的特异性抗体。可见， 52。目前，疟疾 28。 此外，在抗感染方面， 46发现，用 8耐受致死剂量的土丝伦拉 杆菌及李斯特单胞菌的攻击，而且这种保护作用能维持两周并有免疫记忆作用。 在鱼类疾病防治中的应用 13报道，利用 8小时后，在细胞培养液中可检测倒型和型 真等 59通过研究表明， 强其杀菌能力。 待于进一步研究。 增强造血功能 58发现，调抗原递呈细胞的抗原呈递功能，刺激特异性免疫系统产生保护性免疫应答；另一方面，动员机体的造血系统，产生和释放更多的免疫细胞。 第一章绪论 9 生的细胞因子有关。 安全性及面临的问题 安全、有效的佐剂特性受到人们关注。而且由于 细菌、抗寄生虫、抗过敏等作用，应用前景非常乐观。但是，尽管如此仍有一些安全性 问题尚需解决：如 复注射高剂量的 造成其它与过度激活免疫相关的毒性表现 14，。而低剂量一次注射 10倍于常规用量 )，并无明显的毒性效应，小鼠的外观、体重、行为等方面均无明显改变 43。施海晶等 22报道，硫代磷酸酯修饰的 00mg/体治疗日常用量达 4mg/代磷酸酯修饰的 核酸外切