【毕业学位论文】（Word原稿）ARL6IP5基因在原发性肝癌中的生物学作用

兰州大学博士学位论文 1 前 言 原发性肝细胞肝癌（以下简称肝癌）是世界第五大最常见 恶性肿瘤 与第三大致命癌症 1肝癌的发病率在东南亚、中国以及撒哈拉 沙漠 以南非洲最高，而在西方国家相对较低 5。在世界范围内，肝癌的发病率在女性所有恶性肿瘤中位居第七，而死亡率位居第六；在男性所有的恶性肿瘤中，肝癌的发病率位居第五，而死亡率则位居第二 6。 男性发生肝癌的机率较女性高 。 在过去的 二三十年里，肝癌在西方发达国家如澳大利亚的发病率显著增加，预计到 2020 年将翻一倍 7。 据世界卫生组织统 计， 在 2008 年，全世界肝癌新发病例总 人数为748300，死亡总人数为 695900。 肝癌有着明确的危险因素，其中乙肝病毒 (丙肝病毒 (占比率达 80%以上 8在我国，乙型肝炎病毒 是 肝癌发生最主要的独立危险因素。 此外， 在中国由于环境 及食品 污染，药物 滥用问题日益严重，也对各种恶性肿瘤包括 肝癌的发生起有重要作用 。在澳 大利亚 ， 主要原因，其感染者进展为肝癌的可能性比非感染者高出 27 倍13。肝癌的预后很差：在没有远处转移的病例， 5 年存活率也只有 28%, 而一旦发生局部或远处转移 时， 5 年存活率降至 3% (因此，我们迫切需要研究肝癌的分子发病机理，以期寻求敏感特异的肝癌标记物和新的治疗靶点，从而提高肝癌的早期诊断率，并开发更为有效的治疗策略与方案。 在全世界范围内，有超过 的慢性 染者。在澳大利亚，大约有291,000 个 染者，其中 75%为 活动期感染。若无有效治疗， 染者会进一步向肝纤维化发展，最终可发展成为肝硬化。一旦肝硬化出现，其每年发生肝癌的发病率将达到 414。 在 发的肝癌中， 蛋白在其发生发展中起关键作用 15 然而 在 导肝细胞 发生 恶性转化的机理依然没有被阐明。 与 同的是，一种 毒，缺乏基因整合能力。 该病毒可诱发肝脏的慢性炎症，使其发生代偿性再生， 炎症反应与肝细胞再生周而复始，反复相互作用，最终发生基因错配， 伤，肿瘤基质形成。除此之外，一些病毒蛋白可能与重要的细胞信号通路发生相互作用，从而促进肝 细胞 恶性转化 18， 在这些病毒中， 白被认为是最重要的 致癌 病毒蛋白。 心蛋白（ 一种结构蛋白，它形成了病毒衣壳，同时 它可以和某 些与肿瘤形成相关的 信号通路发生相互作用。例如，小鼠肝细胞中过表达此病毒可发展成为肝细胞性肝癌 19, 20。 心蛋白通过激活 2 活化蛋白激酶（ 1, 22、 8和转化生长因子 ( 23 来刺激肝细胞的增殖。 通过与 族蛋白 24、 磷脂酰肌醇激酶 3（ 25、 6以及 7信号通路发生相互作用进而抑制细胞凋亡，促进细胞的增殖。 )，也被称作 。该基因 最初 被 发现于接受过全反式视黄酸处理后的人类支气管上皮细胞 28，之后发现其表达很广泛。该基因位于染色体3 3 个外显子和 2 个内含子组成，其蛋白集中于内质网（ 高尔基体内，关于此基因其他报道相对甚少。 果蝇属 白同源，该蛋白是一个属于烯化的 体家族的小分子蛋白，在内质网与高尔基转运机制中起着一定 的作用 29。啮齿类动物脑组织富含该基因 。 小鼠中 该基因被称为为 大鼠中 则称为 神经元的分化以及调节发挥着作用 30中枢神系统中， 抗氧化防御，细胞信号转导，细胞增殖以及细胞凋亡中均起 着 必要的作用 33。 肿瘤的发生离不开癌基因与抑癌基因的改变，我们在前期胃癌的研究中显示，胃癌组织中，基因 发生了上调，该基因的上调同时影响着胃组织中相关基因（ 达的变化 34。 因的突变与非小细 胞肺癌密切相关 35，前列腺素 酶通过活化早期生长因子 1 和 号轴促进肝癌的发生发展 36，基因 能是一种新型的肿瘤抑制基因，它可以通过调节 合蛋白的表达以及 导的信号通路而抑制乳腺癌的进展 37，在食管鳞状细胞癌的研究中，基因 证实为一种新发现的肿瘤抑制基因 38。 人研究发现 脂酶 肿瘤环境中促进肿瘤的生长和转移等 39。前列腺癌的研究中发现， 号通路被显著活化40其在结直肠癌中的表达增 高或被持续活化 43。 为一种新的前列腺癌生物标记物被发现，抑制 表达有助于前列腺癌的治疗44。有的基因则扮演双向或多重作用，大量研究表明， 化生长因子 ）的效果是不同的，甚至是完全相反的，这完全取决于细胞的类型和周围环境，高干细胞多分化潜能同时增强细胞分化，抑制恶性癌前细胞却促进转移的发生 45。死亡结构域相关蛋白 可以促进凋亡的发生也可以扮演抗凋亡因子的角色，这取决于细胞的类型与外环境的不同， 人卵巢表面上皮细胞肿瘤的表达增高，但在卵巢颗粒细胞瘤中不增高 46。与其他许多基因在不同组织中生物学行为 一样 ，基因 肝组织及肝癌发生发展中如何发挥其功能与作用，目前还未曾有报道。 基 因 表 达 谱 尚有 争议 。 公 开 可 获 得 的 资 料 数 据 库兰州大学博士学位论文 3 （ 显示 ，来自大多数组织的肿瘤包括乳腺癌与肝癌在内，其表达水平高于相应的正常组织。相反地， 47%的卵巢癌 组 织 显 示 该 基 因 表 达 下 调 (在乳腺癌中， 人注意到 表达与肿瘤的大小，分级以及病人生存率无关 47。然而，另一个资料库显示 48， 表达水平越高，肿瘤的体积越小，同时可提高生存率。 因启动子（ C） 中的高频率的单核苷酸多态性（ 已经被报道是一个引起膀胱癌、胃癌、食管癌、绒毛膜癌以及鳞状细胞癌的独立危险因素 49 因结构中 高频率 出现 的 454C A 被认为是中国人 群中白血病的高危因素 52。然而， 体细胞中的突变还未曾在其他实体瘤中注意到 。 迄今，对 肿瘤的发生发展过程中所起的生物学作用研究甚少。已有报道指出， 促进 胞 发生 凋亡 的作用 ， 而此作用是 通过C/介导 53。 此外 ， 多项研究表明， 在宫颈癌细胞、乳腺癌和白血病细胞中，全反式维甲酸与环境应激（ 如 热休克，氧化应激 等 ） 所导致的 抑制增殖与促 进 凋亡 作用都有 导 作用的参与 54敲除 白血病细胞 发生凋亡的能力明显下降 56。 然而，也有 其他研究者发现， 导细胞的增殖 57 但却抑制细胞的迁移 58。例如，过 渡 表达 宫颈癌胞 的 迁移 能力明显下降 ， 而此变化很可能是 通过 号通路 的抑制 作用 而实现。相反， 当 乏时， 细胞的 迁移 能力增强 59。此外，还有报道表明 软组织肿瘤的局部侵袭及转移行为密切相关70。 但是有些报道表明， 肿瘤 细胞 中的 作用 很可能 随着 细胞 的 类型以及细胞所处 的环境不同而 异。例如， 过 渡 表达 C/ 癌细胞株）细胞中 启动子活性 明显受到抑制。 然而 ，在 过 渡 表达 C/胞中 ， 动子的活性 却明显地增强 53。 正常 肝组织 以及 肝癌 的 发生发展中 起什么 作用，目前还未曾有报道。但目前有些研究结果显示，在 基因结构中， 邻近启动子区域 存在着与氧化应激反应密切相关 的结构，这些结构上 存在 热休克反应元件 （ 和应激反应元件（ 28。 与此 相一致的 研究表明， 当乳腺癌细胞接受氰戊菊酯或 理时，会导致 达的 增高，同时会出现 表达 增加和 8 羟基脱氧鸟苷（ 8的生成 增多，而后者 是一个 反映 有力的 标志物 55, 60。 因此，推测 细胞的应激反应密切相关。 兰州大学博士学位论文 4 众所周知， 导致肝癌的最重要原因之一。同时，已经很明确地知道， 肝脏诱导氧化应激和内质网应激，这 也 是 致 肝损伤的经典机制之一61, 62。 临床上也观察到，在 染 者 的肝脏 及血清 中， 氧化应激标志物 （ 包括 8 4） 的 水平明显增加 63一些病毒蛋白与氧化应激的产生 密切 相关， 如 心蛋白 就 存在于线粒体膜上 ，而线粒体 膜也是氧化应激的发生地所在 66. 同时核心蛋白 也 与内质网应激相关 。 表达核心蛋白的转基因小鼠显示出脂质过氧化， 伤 增加 和肿瘤的形成 机率增多 67。 而 非结构蛋白 氧化应激中也扮演者中间介质的角色 。如 以活化 化酶 2， 进而产生活性氧（ 68。 同样，当 合在内质网上时会刺激线粒体活性氧的产生 69。基于 这些结果 ，我们推测 导 的 氧化应激 有可能 导致 表达上调， 而后者在病毒感染诱导的慢性炎症和 肝癌 的发生过程中起有重要作用 。 本研究旨在探讨 肝癌，特别是在 关性肝癌的发生过程中是否起有重要作用。 兰州大学博士学位论文 5 第一部分 肝癌 组织及 胞 中的表达 肿瘤的发生是癌基因与抑癌基因之间 原有 平衡 发生紊乱 的结果 。 基因突变引起基因表达的改变， 进而引起其编码的蛋白发生功能异常，而 蛋白水平发生的变化最终引起细胞行为学的改变， 如 细胞的增殖 、 凋亡等 失控而最终形成肿瘤。 对于临床工作者以及 肿瘤 患者 而言 ，最关心的问题则是肿瘤的治疗问题。随着人类基因组概要完成的宣布， 肿瘤 的靶向治疗已成为 颇具潜力的治疗 各种 手术无法切除的恶性肿瘤的 关键点。 如前所述， 肝癌中 的生物学作用目前尚 未有过报道。 因此，该基因在肝癌的发生发展中究竟有无作用，有何作用，如何起作用等是我们 本研究的主要目的。 在本章节中，我们的主要实验目的为： （ 1） 在人类 肝癌组织，特别是 关性肝癌组织中， 平和 蛋白水平的表达情况 ， 并比较 癌组织与 癌旁组织 中该基因 的表达情况； （ 2）检测经过致癌剂 理的 小鼠肝脏 肿瘤 组织 和非肿瘤组织 中 表达情况； （ 3） 在人肝癌细胞株 染 心蛋白 后，检测 和 比较 该基因的表达情况 。 这 些实验结 果 会初步揭示 该基因在肝癌中的可能作用，并 为后续检测该基因的生物学功能实验提供明确的方向。 验材料 组织标本、细胞株和主要试剂 （ 1） 组织标本：所有人肝癌组织标本均由澳大利亚 院提供，其中包括 性病例和阴性病例，每个患者标本包括癌组织与癌旁组织； （ 2） 细胞株： 院细胞库提供）； （ 3） 胎牛血清（ 由澳大利亚 司提供； （ 4） 美国 公司 司提供； （ 5） 杜氏磷酸盐缓冲液（ 由美国 公司 司提供； （ 6） 含有 胰酶（ 10X）：由美国 司提供； （ 7） 二甲基亚砜（ 由美国 司提供； （ 8） 细胞计数板：由美国 司提供； 兰州大学博士学位论文 6 （ 9） 提试剂盒（ ：由中国台湾 （ 10） 录合成试剂盒： a. 转录酶， b. 转录酶缓冲液（ 5X），由美国 司提供； （ 11） 由美国 司提供； （ 12） 18s 针： 5由美国 司提供； （ 13） ：由美国 司提供； （ 14） 10X 美国 司提供 ； （ 15） 50美国 司提供； （ 16） 10mM 美国 司提供； （ 17） 250ng/美国 司提供； （ 18） 基因 物：正向引物： 5反向引物： 5由美国 司提供； （ 19） 白定量试剂盒：由美国 司提供； （ 20） 二烷基磺 酸钠 )：由美国生化试剂公司 供； （ 21） 美国生化试剂公司 供； （ 22） 甘氨酸：由美国 司提供； （ 23） 超纯三羟甲基氨基甲烷（ ：由澳大利亚司提供； （ 24） 过硫酸铵（ 由美国 司提供； （ 25） 30%甲叉双丙烯酰胺混合液：由美国 司提供； （ 26） 美国 司提供； （ 27） 美国 司提供； （ 28） 号为 26619，由美国 （ 29） 硝酸纤维素膜 (编号为 162美国 司提供； （ 30） 脱脂奶粉：由澳大利亚 粉公司提供； （ 31） 牛血清白蛋白（ 由美国 司提供； （ 32） 无菌去离子冲洗水（ ：由澳大利亚 疗公司提供； （ 33） 抗： 抗人抗体，由美国 司提供； （ 34） 抗： 抗人单克隆抗体，由美国 司兰州大学博士学位论文 7 提供； （ 35） 抗： 抗人单克隆抗体，由美国 司提供； （ 36） 一抗： 4370S， 2)(兔抗人单克隆抗体，由美国 司提供； （ 37） 抗： 4631S， 兔抗人单克隆抗体，由美国 司提供； （ 38） 抗： 9255S， 鼠抗人单克隆抗体，由美国 司提供； （ 39） 二抗：抗兔，由美国 司提供； （ 40） 二抗：抗鼠，由美国 司提供； （ 41） 敏感化学发光试剂盒 )：由美国 司提供； （ 42） 通化学发光试剂盒 )：由美国 司提供； （ 43） 高性能化学发光片：由英国 司提供； （ 44） 显影液：由比利时 疗公司提供； （ 45） 定影液：由比利时 疗公司提供； （ 46） 细胞培养瓶（ 美国 司提供，英国制造； （ 47） 吸管（ 25102550美国 （ 48） 细胞培养多孔板 ： 6 孔， 12 孔， 24 孔， 48 孔， 96 孔，由美国 （ 49） 50ml 丙烯锥形收集管）：由美国 司提供； （ 50） 15ml 丙烯锥形收集管）：由美国 司提供； （ 51） 无菌细胞冻存管： 德国 司提供； （ 52） 微量可调移液器： 210202001000德国 （ 53） 微量移液器过滤枪头： 10202001000美国 司提供； （ 54） 量离心管：由美国 司提供。 兰州大学博士学位论文 8 相关溶液的配制 （ 1） 含 10%胎牛血清的细胞培养基：将一支分装好的胎牛血清从 箱取出，放入 37水浴箱，大概 15 分钟由冰冻状态溶解为液态，取出放入超净台，同时将一瓶购买好备用的 500入超净台，将溶解好的胎牛血清 56入 500 ，配成含有 10%胎牛血清的 封好瓶盖，将其放入 4储藏室保存。 （ 2） 1X 胰酶：将含有 胰酶（ 10X）使用杜氏磷酸缓冲液（ 行 10 倍稀释，稀释成为工作浓度的胰酶， 1酶，加入 9封好瓶盖，将其放入 箱保存，以上操作均为无菌操作，需在超净台下进行稀释。 （ 3） 细胞冻存液（ 10% 从 箱中取出一支分装好的胎牛血清，将其放入 37水浴箱中，大概 15 分钟后溶解，取出放入超净台，将一支未打开的 5装的 入超净台，并打开，将其加入 45胎牛血清中，配成含有 10% 90%胎牛血清的细胞冻 存液，混匀后， 箱保存。 （ 4） 细胞组织蛋白抽提缓冲液（ :总体系为 1L，所需加入试剂如下， 50 1M 150 1M 化钠） ,50M 化钠）， 5000,2 二胺四乙酸）， 2 二醇四乙酸酯），加入 3蒸水）至总体积为 1L。此缓冲液可长期保存于室温 中，每次使用时，需使用此缓冲液来配制新鲜蛋白裂解缓冲液。 （ 5） 新鲜蛋白裂解缓冲液（ :此缓冲液只能每次使用时新鲜配制，配好之后，置于冰上，一个小时之内用完。配方如下， 5M 硫苏糖醇 )， 4 125甲基磺酰氟 ，蛋白酶抑制剂 )， 200 氏蛋白酶抑制剂混合物，25X)， 10 500酸钠 )， 50甘油 ， 50乙二醇辛基苯基醚） ,加水至 5匀并使用。 （ 6） 10%过硫酸铵（ 以 10总体系，将 1g 过硫酸铵溶于 104保存。 （ 7） 离胶（ 10%）：以 10总体系，所需试剂及其体积分别为， 蒸水）， 30%丙烯酰胺混合液， 10% 10%4 兰州大学博士学位论文 9 （ 8） 离胶（ 12%）：以 10总体系，所需试 剂及其体积分别为， 蒸水）， 30%丙烯酰胺混合液， 10% 10%4 （ 9） 缩胶（ 5%）：以 6总体系，所需试剂及其体积分别为， 蒸水）， 30%丙烯酰胺混合液， 60 10%60 10%6 （ 10） 10X 泳缓冲液（ 以 1L 为总体系，所需试剂及其量分别如下， 30g 44g 甘氨酸 ,10g 先溶解在 700蒸水中，进行搅拌充分混匀，然后继续加入双蒸水至 1L，室温保存，每次使用时，将其进行 10 倍稀释，然后使用。 （ 11） 4X 样缓冲液： 200400硫苏糖醇 ),8%酚蓝， 40%甘油，室温保存，用时再加 8%。 （ 12） 10X 膜缓冲液（ 以 1L 为总体系，所需试剂及其量分别如下， 30g 144g 甘氨酸 ,加入双蒸水至 700充分搅拌混匀，定容至 1L，室温保存。 （ 13） 1X 以 1 1000X 膜缓冲液，加入甲醇 200去离子水至 1L， 4保存。 （ 14） 10X 冲液：以 2L 为总体系，所需试剂和剂量分别为， 入去离子水至 进行充分搅拌混匀，使用浓盐酸（ 调整 至 大概需要 80用 监测仪进行实时监控，当 ，继续加入去离子水至 2L，室温保存，避光。 （ 15） 1X 缓冲液：以 1L 为总体系，用 50管分两次从 10X 00入 45%的 4005%的 水定容至 1L,4保存。 （ 16） 5%脱脂奶粉：奶粉 5g,加入 100X ,充分搅拌混匀， 4保存。 （ 17） 5%0X ,充分搅拌混匀， 4保存。 （ 18） 1:1000 一抗： 10体，加入 10%脱脂奶粉或 5%充分搅拌混匀， 存。 （ 19） 1:10000 一抗： 1体，加入 10%脱脂奶粉或 5%充分搅拌混匀， 存。 （ 20） 1:10000 二抗： 1体，加入 10%脱脂奶粉或 5%充分搅拌混匀， 存。 兰州大学博士学位论文 10 相关仪器设备 （ 1） 养箱：由美国 司提供； （ 2） 细胞培养用超净台：由澳大利亚 司提供； （ 3） 电子秤： 日本 司提供； （ 4） 分光光度计： 美 国 司提供； （ 5） 时荧光定量 ：由美国 司提供； （ 6） 涡旋混合器：由美国 司提供； （ 7） 通用台式摇床：由美国 司提供； （ 8） 组织均质器：由德国 司提供； （ 9） 干式加热器：由澳大利亚 司提供； （ 10） 迷你微孔板离心机：由美国莱伯特（ 公司提供； （ 11） 制冰机： 日本星崎 （ 司提供； （ 12） 37孵育箱：由德国 司提供； （ 13） ： 700,由美国 供； （ 14） ： CR 美国 司提供，英国制造； （ 15） 变压器： C，由美国 司提供； （ 16） 变压器： 200/美国 司提供； （ 17） 小型台式高速冷冻离心机： 5424R，由德国 司提供； （ 18） 超速低温离心机： 德国 造商提供； （ 19） 流体动力通风橱：由澳大利亚 司提供； （ 20） 普通荧光显微镜 ： 日本奥林巴斯公司提供； （ 21） 显影定影仪： 德国 司提供，中国注册。 验方法 胞的培养、冻存与复苏 （ 1） 细胞的培养：来自 病研究所培养好的第二代 胞株（肝癌细胞株），培养于 养瓶中，生长状态良好，将其放入超净台，取出配好的含 10%血清的 全培养基），将其加入 3 支新的 养瓶中，每瓶加入 10生长好的培养瓶打开，弃去上清液，加入温热好的 行冲洗 1，弃去 入 2X 胰酶，盖好瓶盖，来回轻轻摇晃，使 胰酶平铺于培养瓶中，将其放入 37孵育箱中，大概 3分钟后（由于 胞株贴壁能力很强，需要较长时间胰酶的消化作用），兰州大学博士学位论文 11 取出，肉眼观察，可见大片细胞从瓶壁上逐渐脱落，镜下观察，细胞突起消失并回缩，外周变圆，变钝。放入超净台，打开，即刻加入 5全培养基，此时，培养基中的血清可终止胰酶的消化作用，防止胰酶进一步作用而损伤细胞，用吸管来回吹打大概 50，这样的作用可使细胞尽量分散为单细胞，吹打好之后，将其分别加入三个已配好的新鲜培养基中（ 1/3 传开），置于 37 ,含 5%培养箱中。每天在显微镜底 下观察其生长状态，一般首先置于低倍镜下 (10察 ,主要有细胞生长密度，细胞的形态，细胞生长指数等。细胞生长状态很重要，当受到污染时，会影响后续实验结果，包括各种基因蛋白在细胞中的表达情况，一般的污染容易发现，但是当感染支原体时，很难在显微镜下观察到，主要鉴别点在于其生长速度明显慢于正常情况，当感染程度严重时，在高倍镜下观察，可以看到细泥沙样改变，但是很难明确鉴别。一般当细胞生长密度达到 50%时为最佳状态，此时可以进行传代或者后续实验，最高生长密度不要超过70%，否则会影响各类因子的正常表达。当进行细 胞传代时，先弃去上清液，使用 洗 1，加入胰酶消化等，如前所述，方法一样。 （ 2） 细胞的冻存：当细胞生长代数处在早期时，可以大量传代培养一批细胞，冻存起来，可以以后随时复苏使用。一般选择大培养瓶（ ，培养 5其生长密度达到 50%，开始收集细胞。首先，如前所述，弃去培养液，使用 行冲洗，然后加入 3X 胰酶于每个大培养瓶中，放入 37细胞培养箱中，大概 3 分钟，取出，加入完全培养基 5止胰酶作用，开始吹打细胞，将所有培养瓶中细胞吹打下来，混合在一个 无菌的 50料离心管中，开始离心， 800 4出后立即弃去上清液，加入 10吹打混匀，再次离心， 800 4出后立即弃去上清液，尽量将 干净，此时加入事先已经配好的细胞冻存液（含 10% 胎牛血清），要逐渐少量加入，否则会杀死更多的细胞。以 5 个大培养瓶计算，一般需要 15存液，混匀后，将其分装于 10 个冻存管中，密封好，贴上标签，包括日期，名称，以及细胞的代数（比如 第六代），实验人员的姓名等。放入细胞管架上，将细胞管架放入一个白色 泡沫盒中，盖上盖子，里面有较大空间（这样细胞的温度可以逐渐下降，以免速冻而冻伤或冻死细胞），密封好放入 箱中，第二天将其取出，将细胞冻存管移至普通试剂储存盒中，一般可保存 1 年。 （ 3） 细胞的复苏：首先，准备好完全培养基，预热培养基，之后放入超净台，吸管吸出 15养液加入一支新的中培养瓶中（ 此时，从 兰州大学博士学位论文 12 箱中取出一支冻存的 胞株，将其取出后迅速放入 38水浴锅中，此时可用手拿着在水浴锅中进行来回摇晃，使其溶解，大概需要一分钟，拿出后放入超净台，打开，小心缓慢的使用加样枪将其吸出再加 入含有新鲜培养基的培养瓶中，盖好瓶盖，来回轻轻摇晃，置于 37， 5%胞培养箱中。这里有个原则：慢冻快溶，冻存细胞时，使其温度逐渐降低，溶解细胞时，使其温度迅速升高，这会把对细胞的损伤降到最低。刚才的操作中，没有进行离心并弃去冻存液，这是由于离心对细胞的损伤远大于残留的 细胞的损伤，而且加入培养基后， 浓度已由原来的 10%降至小于 1%，因此我们选择不离心。观察细胞，一般过夜后，为细胞换新鲜培养基，首先弃去上清液， 洗 1，直接加入新鲜完全培养基，观察细胞生长状态，当细胞生长 密度达到 50%时，可进行传代，一般刚刚复苏的细胞，需要传代 2后方可使用，使其细胞内各因子的表达恢复到正常状态，后续细胞培养方法与之前所述一样。（所有实验室的任何操作，需全程戴实验室专用手套和白大褂）。 织标本的收集 （ 1） 人肝癌组织：所有人肝癌组织及癌旁组织均由 院手术外科医生提供，由 病研究所乔梁教授收集并核查，组织均为新鲜标本，并冻存于 箱中，所有获得的组织均受到患者本人及其家属的同意，每个标本存于冻存管中，每个冻存管都贴上相关标签，包括标本的编号及其是否 性， 每组标本均由一对组成，癌组织与癌旁组织。共 8 对组织， 4 对 性， 4 对 性。 （ 2） 急性 理小鼠肝组织：从获得小鼠到拿到肝组织，均由 病研究所 士后完成并予提供。组织标本为， 6龄小鼠，一次性腹腔内注射 150mg/ 二 乙 基 亚 硝 胺 ） ，分别在 0h ，12h,24h,36h,48h,72h,96h,144h 给予小鼠安乐死，同时摘取小鼠肝组织。 （ 3） 慢性 理小鼠肝组织：从获得小鼠到拿到肝肿瘤组织，均由 授研究小组完成并予提供。 组织标本为 经过 48 周理后形成的小鼠肝肿瘤组织： 2 周龄小鼠，一次性单剂量腹腔内注射 50mg/重），经过 48 周的正常饲养后，行安乐死，并摘取小鼠肝癌组织及非癌肝组织 。 （ 4） 第 1 代 相同代数 胞株：由 病研究所 1 代 胞株是指在普通 胞株感染 13 核心蛋白 录 后经过第一次传代以后所获得的细胞，亦即第 1 代感染 胞株，而这里的普通 胞株可以是 50 代）以内的细胞 株，在感染 后的 般在5 代以内均可使用，其转染效率在 5 代以内可维持至 70%以上，第 2,3 代最佳，均能达到 90%以上， 5 代之后会迅速下降，不能使用。 时荧光定量 测 织 提取：首先，获取一些干冰置于一个大小适中的白色泡沫盒内，将获得的组织从 箱中取出，置于干冰上，拿出少量干冰放于一个不锈钢托盘底下，使托盘低温冷却。此时切取每个标本组织，从干冰中取出一个标本，用镊子拿出，放于托盘上，使用实验室解剖刀进行切割，切取大小为大概30右，第一块组织可进行称 重，其余肉眼观大小同前差不多即可，切取后迅速将其置于 心管中，置于干冰上，每个组织标本的切取方法一致。切好之后，准备 提液，从 提试剂盒中取出 解液，使用前，每 1加入 10巯基乙醇。具体实验步骤如下： （ 1） 加入 350解液（含 每个离心管中，裂解液会在干冰环境下迅速结为固态，每个离心管中加入一个不锈钢金属小球（匀质专用），全部加好后，将其置于匀质器内，开始振荡， 302 （ 2） 取出离心管，室温放置 3心吸出全部上清液，转入一个过滤柱（ 中 ,置于离心机内， 1100024； （ 3） 将过滤得到的澄清液转入新的离心管中，加入等体积（ 35070%乙醇，来回吹打混匀； （ 4） 将上述混悬液转入 型柱 )， 110000 ,弃去过滤液； （ 5） 加入 500 于每个柱子中， 1100010，弃去过滤液； （ 6） 加入 750 于每个柱子中， 1100010，弃去过滤液； （ 7） 重复步骤 6； （ 8） 将含有柱子的离心管继续放回离心机内， 14000 速） ,30 ,此步用来干燥柱子； （ 9） 将柱子放入新的离心收集管中，每个收集管中加入 50 的去离子水，盖上柱子的盖子，室温放置 1去离子水完全浸透于柱子中的兰州大学博士学位论文 14 滤膜内； （ 10） 离心， 11000； （ 11） 弃去柱子，此时得到的过滤液则为 速置于普通冰上； （ 12） 使用 光光度计检测 度； （ 13） 贴上每个 本的编号以及浓度于每个收集管上 ， 存。 胞 提取： （ 1） 首先，加入 350解液（含 每个孔（六孔板，细胞培养用）中，室温静置 3 分钟； （ 2） 加入等体积（ 35070%乙醇，来回吹打混匀； （ 3） 将上述混悬液转入 型柱 )， 110000 ,弃去过滤液； （ 4） 其余步骤同组织 提取（第 5 步以后）。 合成：首先计算所需 体积，以 10总体系，一般合 成 需要的 500体如下： （ 1） 2O= 500 （ 2） 10=（ 3） 随机引物（ 250ng/=（ 4） 混合上述试剂，置于 66 ,5即迅速将其放置冰上 1（ 5） 加入 转录酶， 2转录酶缓冲液（ 5X）， （ 6） 吹打混匀，置于 37 ,1 小时 时 10 分钟， （ 7） 将合成的 于 箱中。 时荧光定量多聚酶链反应）： （ 1） 管家基因 18s 探针）：以 20总体系，所需试剂及其剂量如下：10X 210mM 50：18s 家基因） 离子水： （ 2） 目的基因（引物）：以 20总体系，所需试剂及其剂量分别如下： 2X 10游引物（ 10M） ： 1游引物（ 10M） ：1离子水： 35 （ 3） 上述体系配好之后，开始上机（ 时荧光定量 ）进行扩增反应，反应条件分别为： 18s：第一阶段，预变性， 95 /3二阶段，变性 95 /15(40 个循环 )。由于我们所选用的管家基因 18s 探针，在分析结果时不会产生融解曲线（ ,因此在第二阶段结束后，即可终止反应；目的基因：第一阶段，预变性，兰州大学博士学位论文 15 95 /20s,第二阶段，变性 95 /3(40 个循环 ),第三阶段，延伸反应， 95 /15 /15s(此阶段所需时间较长 )，在这里，我们所选用 的目的基因反应条件为 司推荐的标准条件，